VEGF

Psiquiatría molecular (2023)Citar este artículo

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La activación de la inmunidad innata en el cerebro es una característica destacada de la enfermedad de Alzheimer (EA). El presente estudio investigó la regulación de la inmunidad innata mediante la inyección de suero de tipo salvaje en un modelo de ratón transgénico con EA. Descubrimos que el tratamiento con suero de ratón natural redujo significativamente la cantidad de neutrófilos y la reactividad microglial en los cerebros de ratones APP/PS1. Imitando este efecto, el agotamiento de los neutrófilos a través de los anticuerpos neutralizantes Ly6G resultó en mejoras en las funciones cerebrales de la EA. El análisis proteómico sérico identificó el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) y el ligando 1 de quimiocina (motivo CXC) (CXCL1) como factores enriquecidos en muestras de suero, que son cruciales para la migración y quimiotaxis de neutrófilos, la migración de leucocitos y la quimiotaxis celular. El VEGF-A exógeno revirtió las disminuciones inducidas por el β amiloide (Aβ) en la quinasa 5 dependiente de ciclina (Cdk5) y los aumentos en CXCL1 in vitro y bloqueó la infiltración de neutrófilos en el cerebro con EA. La sobreexpresión endotelial de Cdk5 confirió un efecto inhibidor sobre CXCL1 y la infiltración de neutrófilos, restaurando así la capacidad de memoria en ratones APP/PS1. Nuestros hallazgos descubren un vínculo previamente desconocido entre la señalización de VEGF derivada de la sangre y la infiltración de neutrófilos y respaldan la orientación de la señalización de Cdk5 endotelial como una posible estrategia terapéutica para la EA.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es el tipo prevalente de demencia que afecta principalmente a pacientes de edad avanzada. La beta amiloide (Aβ) y los ovillos neurofibrilares (NFT) en el cerebro son las principales características patológicas de la EA. Cada vez hay más evidencia que sugiere que los factores circulatorios, incluidas las células inmunitarias y las citocinas relacionadas, pueden estar asociados con cambios patológicos en modelos de ratón con EA [1,2,3,4,5]. Se ha descubierto que los neutrófilos, como leucocitos innatos más abundantes en la sangre periférica, aumentan en la sangre de pacientes con EA con demencia [6], en el parénquima cerebral de pacientes con EA [7, 8] y en varios modelos de ratón con EA. [4, 9,10,11]. Además, los factores sistémicos en la sangre de ratones jóvenes pueden rejuvenecer la neurogénesis, la plasticidad sináptica y las funciones cognitivas en ratones que envejecen [12, 13] y viceversa [14], lo que indica que los factores sistémicos desempeñan un papel importante en la modulación del comportamiento del huésped, la inmunidad. y funciones cerebrales [15,16,17]. Por tanto, estos estudios sugieren que la inmunidad innata, incluidos los neutrófilos, puede desempeñar un papel crucial en el desarrollo de la EA [4, 6,7,8, 18]. Sin embargo, se sabe poco sobre cómo este mecanismo puede estar relacionado con las terapias que utilizan sangre joven y otras estrategias terapéuticas que involucran factores circulantes. Además, aún no se han determinado los factores sistémicos clave que subyacen a la homeostasis de la inmunidad innata en el cerebro con EA.

Como factor transmitido por la sangre, se ha demostrado que la señalización del factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) participa en detener la neurodegeneración y el deterioro cognitivo relacionados con la EA [19,20,21]. Se ha descubierto que una señalización insuficiente de VEGF afecta el envejecimiento multiorgánico, incluida la cognición cerebral en ratones, mientras que una señalización mejorada de VEGF puede prevenir la pérdida capilar en el cerebro asociada a la edad y prolongar la vida útil [22]. VEGF-A también puede aumentar la neurogénesis del hipocampo en ratones jóvenes [23, 24] y enviar señales a las células endoteliales del hipocampo, que son sensores esenciales de factores circulatorios relacionados con la edad [25]. Se ha descubierto que VEGF previene la pérdida del receptor AMPA inducida por Aβ y rescata la disfunción sináptica mediante la acción directa sobre las sinapsis [26].

En este estudio, revelamos que la cantidad de neutrófilos inflamatorios disminuyó en la periferia y el cerebro en ratones APP/PS1 después de la inyección de suero de tipo salvaje. Además, buscamos descubrir el papel de la señalización endotelial de VEGF-A/quinasa 5 dependiente de ciclina (Cdk5)/ligando 1 de quimiocina (motivo CXC) (CXCL1) en el proceso de infiltración de neutrófilos en el cerebro de ratones APP/PS1. Nuestros resultados demuestran que apuntar a los neutrófilos y/o la señalización de moléculas de tráfico para reequilibrar el microambiente inmunológico en el cerebro es una estrategia prometedora para la terapia de la EA.

Se obtuvieron ratones transgénicos APP/PS1 (APPswePSEN1dE9) macho de ocho meses de edad sobre un fondo C57BL/6, ratones de tipo salvaje (WT) de la misma edad y ratones C57BL/6 macho de 4 a 6 semanas de edad. Instituto de Investigación Biomédica de Nanjing de la Universidad de Nanjing (Nanjing, China). Los promotores de ambos transgenes en los ratones transgénicos APP/PS1 que coexpresan el gen APP humano mutado KM670/671L y el gen PSEN1 mutado M146L están controlados por la transcripción de lectura directa de la proteína priónica de ratón (Prn). Se adquirieron ratones transgénicos Cx3cr1-GFP (B6.129P-Cx3cr1tm1Litt/J) del Laboratorio Jackson (n.º de stock: 005582). Los animales se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal (ip) de 250 mg/kg de tribromoetanol (T48402, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y alcohol terc-amílico al 2,5 % (240486, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) se filtró con un filtro de 0,22 µm (Millipore, MA, EE. UU.), se recogió sangre y el cerebro se perfundió con solución salina fría y/o PFA al 4 % antes de la recolección. Todos los animales se alojaron en condiciones de temperatura y humedad controladas y se mantuvieron en un ambiente con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Todos los protocolos experimentales cumplieron con las regulaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Sun Yat-sen. Los animales fueron excluidos de los experimentos cuando mostraban un estado obvio de comportamiento similar a una enfermedad, como estar inmóviles en las pruebas OFT y MWM o morir antes o durante los experimentos.

Se recogió suero de ratón de ratones C57BL/6 machos jóvenes (n = 150; 4 a 6 semanas de edad) después de un sangrado retroorbitario. Se preparó suero a partir de sangre completa después de una incubación durante 1 h a temperatura ambiente y a 4 ° C durante la noche y una centrifugación a 4000 x g. El suero de ratón combinado se filtró a través de un filtro de jeringa estéril con un tamaño de poro de 0,22 µm (Millipore), se dializó utilizando un casete Slide-A-Lyzer™ (Thermo Scientific) y luego se almacenó a -80 °C. Ratones APP/PS1 macho de ocho meses de edad (n = 20) y compañeros de camada WT de la misma edad (n = 20) fueron tratados sistémicamente con 9 inyecciones de suero (200 μL/inyección) o una cantidad igual de PBS estéril en la cola. vena cada 3 días. Todos los ratones (~9 meses de edad) fueron sacrificados 48 h después de la prueba de condicionamiento del miedo; n = 7–10 para las pruebas de comportamiento y n = 4–15 para ensayos histológicos y bioquímicos [27]. El tamaño de la muestra se eligió en base a estudios previos similares en EA [3, 4, 10]. Todas las muestras fueron asignadas aleatoriamente a grupos con tamaños de muestra aproximadamente equilibrados.

El condicionamiento del miedo se realizó en una cámara con dimensiones internas de 20 cm de ancho x 20 cm de profundidad x 30 cm de alto (Coulbourn Instruments, EE. UU.). Se colocaron ratones macho individualmente en la cámara de prueba. Después de un tiempo inicial (192 s), los animales recibieron tres pares de choque tonal. El estímulo condicionado (CS) fue un tono puro (20 s de duración, 4000 Hz, 60 dB), que fue seguido inmediatamente por una descarga eléctrica continuamente codificada aplicada en el piso de la rejilla (estímulo incondicionado, US: 2 s, 0,5 mA). Cada emparejamiento de tono-descarga fue seguido por 64 s de tiempo, y los ratones permanecieron en el contexto A durante otros 64 s después del tercer choque. Veinticuatro horas después del acondicionamiento, los ratones fueron colocados nuevamente en la cámara de prueba durante 320 segundos y se les puntuó el tiempo de congelación (condicionamiento contextual). Posteriormente, los animales fueron trasladados a una nueva cámara con paredes internas de plástico negro sin perfume y ropa de cama en el suelo y se les puntuó su congelación durante un período de referencia de 192 s seguido de una exposición de 320 s a un tono idéntico al estímulo condicionado (condicionamiento con señales). ). El protocolo detallado se ha descrito anteriormente [28].

La prueba MWM se realizó con ratones macho, como se describió anteriormente con una ligera modificación [29]. Brevemente, durante la fase de adquisición, a los ratones se les dio una prueba de entrenamiento por día para ubicar una plataforma oculta ubicada a 1,0 cm debajo de la superficie del agua en una piscina, utilizando las distintas señales visuales colocadas en la pared interior de la piscina. El tiempo máximo dado para cada prueba fue de 60 s. Un ratón no logró llegar a la plataforma en 60 segundos y fue guiado manualmente hasta la plataforma y permaneció durante 10 segundos antes de regresar a la jaula. El intervalo entre ensayos para cada ratón fue de 10 min. Durante la fase de sonda, se retiró la plataforma y los ratones recibieron una única prueba que duró 60 s sin escape disponible. Las trayectorias de natación se registraron con el sistema de seguimiento de vídeo TopScanTM 2.0 (Clever Sys., Inc., Reston, VA, EE. UU.). Todas las pruebas de comportamiento se realizaron entre las 10:00 y las 17:00 horas en la fase de apagado de las luces.

Bajo anestesia profunda, a los ratones se les perfundió transcardialmente solución salina fría estéril y se les extrajo el cerebro inmediatamente. Un hemisferio se congeló en nitrógeno líquido y el otro hemisferio se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante 24 h y se equilibró en sacarosa al 15% en tampón fosfato (PB) 0,1 M, seguido de sacarosa al 30%. Luego, se recogieron secciones congeladas del hipocampo de 40 μm de espesor utilizando un microtomo deslizante Leica SM2000R (Leica Microsystems, Richmond Hill, Ontario, Canadá) y se almacenaron a 4 ° C hasta que se realizó la tinción por inmunofluorescencia. Los cortes de cerebro se seleccionaron a una equidistancia continua de cinco cortes coronales espaciados 240 μm. Los hemisferios congelados se homogeneizaron y se extrajeron a 4 °C en tampón RIPA (ensayo de radioinmunoprecipitación) (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 1% y SDS al 0,1%) que contenía 1% de fosfatasa y 1% de inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) utilizando un homogeneizador TissueRuptor (Qiagen, DUS, Alemania); el homogeneizado se centrifugó durante 30 minutos a 12.000 x g (Eppendorf, HAM, Alemania) y el sobrenadante se recogió como fracción soluble en RIPA. El sedimento se volvió a extraer en SDS al 2 % y Tris-HCl 50 mM, pH 7,4. El sobrenadante se recogió como fracción soluble en SDS.

Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-Aβ1-42 de ratón (1:1.000; A5213, Sigma-Aldrich), anti-CD68 de rata (1:400; MCA1957, Bio-Rad), anti-Iba-1 de conejo (1: 1.000; Wako Chemical), receptor 1 anti-glutamato de ratón (1:400; ab183797, Abcam), anti-sinaptofisina de ratón (1:200; S5768, Sigma-Aldrich), Ly6G anti-ratón de rata (1:200; BP0075, Bioxcell), antimieloperoxidasa de ratón (MPO, 1:1000; AF3667-SP, I+D), elastasa anti-neutrófilos de ratón (NE, 1:1000; MAB4517-SP, I+D), anti-Ki67 de rata (1:500; SolA15) , eBioscience), anticuerpo policlonal anti-Claudin5 de conejo (1:400; YT0953, Immunoway) anti-pCdk5 de ratón (1:400; C-7, Santa Cruz) y anti-Cdk5 de ratón (1:400; DC 17, Santa Cruz ). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios: Alexa Fluor 647 burro anti-ratón, Alexa Fluor 594 burro anti-rata, Alexa Fluor 488 burro anti-cabra, Alexa Fluor 555 anti-conejo de cabra y Alexa Fluor 488 anti-conejo de cabra (1: 400, Invitrogen). Se utilizaron anticuerpos anti-CD31 conjugado con PE (1:100; 553373, B&D), anti-CXCL1 conjugado con FITC (1:100; IC4532G, B&D) y lectina marcada con DyLight 649 (1:200; L32472, InvitrogenTM). Algunos experimentos de inmunofluorescencia. Los protocolos detallados de inmunofluorescencia se han descrito anteriormente [30].

Se utilizó un microscopio de barrido láser confocal LSM 780 u 800 (microscopía Carl Zeiss) para capturar imágenes representativas de las secciones utilizando los mismos parámetros para evitar posibles artefactos técnicos. Se utilizó el software ImageJ (NIH) para la intensidad media de la cuantificación de la señal de fluorescencia en la región de interés en cada imagen. Para el análisis de colocalización en la figura complementaria 4, análisis de distribución del perfil de intensidad de fluorescencia de Cdk5 y pCdk5 con CXCL1 utilizando ZEN 2.3 (microscopía Carl Zeiss). En una descripción detallada, abra una microscopía de fluorescencia confocal usando ZEN 2.3 (edición azul) y seleccione "Procesamiento", luego seleccione "Definición de perfil", la distribución de la señal de fluorescencia se puede mostrar en gráficos a lo largo de la flecha. La lista de datos de intensidad de fluorescencia se puede encontrar en la "Tabla de perfiles". Para la reconstrucción 3D, las imágenes confocales originales de pila Z se obtuvieron utilizando una lente de inmersión en aceite de 63 × con Zoom digital 2.0 mediante un microscopio LSM 780. Luego, se utilizó el software Imaris (Bitplane, versión 8.4) para renderizar y obtener imágenes reconstruidas en 3D utilizando la “herramienta de superficie”. Después de la reconstrucción, se utilizó una herramienta de zoom digital para ampliar la imagen, como se muestra en la Fig. 7H (derecha) y I. Los puntos GluA1+ se representaron utilizando la "Herramienta Spot". Los puntos distribuidos dentro de la microglia se definieron como puntos sinápticos engullidos. La distancia es inferior a 0 μm desde la superficie microglial y los puntos de contacto distribuidos fuera de la microglia, pero la distancia es inferior a 0,25 μm desde la superficie microglial.

Para el análisis de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se recogieron 200 µl de muestra de sangre completa de otro conjunto de ratones APP/PS1, APP/PS1 + suero y APP/PS1 + Ly6G en tubos de centrífuga de 2 ml que contenían heparina sódica al 1 % ( 10 µl). Después de la anticoagulación, la solución se diluyó con solución salina estéril igual. Las PBMC se aislaron utilizando tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio (ACK) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los animales fueron perfundidos con solución salina fría estéril para eliminar la sangre periférica restante y se recogieron los cerebros. El método para la generación de células inmunes cerebrales se utilizó en un estudio anterior con ligeras modificaciones [31]. El cerebro fue rápidamente disecado y sumergido en una solución salina equilibrada de Hank (HBSS) fría. El cerebro se picó con tijeras y se homogeneizó utilizando un homogeneizador Dounce en HBSS helado 30 veces sin burbujas. Luego, la suspensión celular se transfirió a un tubo de 15 ml previamente enfriado y se filtró a través de una malla de nailon de 70 μm previamente humedecida (HBSS). La mielina y los desechos se eliminaron utilizando un gradiente de Percoll frío modificado al 40% (Merck Millipore, 17-0891-02) mediante centrifugación durante 30 minutos a 500 × g sin aceleración ni frenado. El sedimento de células inmunes contenía microglía, monocitos y neutrófilos en el fondo de un tubo de 15 ml. Las muestras se marcaron con anti-CD45 conjugado con FITC (0,25 mg/106 células; 11-0451-81, eBioscience), anti-CD11b conjugado con PE-Cyn7 (0,125 mg/106 células; 25-0112-81, eBioscience) , anti-CD62L conjugado con APC (0,5 mg/106 células; 553152, B&D), anti-CXCR4 conjugado con FITC (0,5 mg/106 células; 551967, B&D), anti-Ly6G conjugado con PE (0,5 mg/106 células; E-AB-F1108D, Elabscience), anti-Ly6C conjugado con EF450 (0,5 mg/106 células; 48-5932-80, Invitrogen), anti-CD31 conjugado con PE (0,25 mg/106 células; B&D, 553373, MEC 13.3 ), anticuerpos anti-VEGFR2/FLK-1 conjugados con BB700 (0,25 mg/106 células; 742184, B&D) y anti-CXCL1 conjugados con FITC (0,6 mg/106 células; IC4532G, B&D) en una dilución de 1:100 para 30 min en hielo. Las muestras experimentales se analizaron utilizando un citómetro de flujo (Beckman CytoFLEX S, CA, EE. UU.).

Los perfiles de citoquinas del suero de los grupos WT + PBS, WT + Suero, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + Suero (n = 1 mezcla de cuatro muestras de suero) se analizaron utilizando una matriz de anticuerpos de citoquinas de ratón (CAT # QAM-CAA-4000; RayBiotech, ATL, EE. UU.) y probado según los protocolos experimentales. Se utilizó una combinación de factores, incluida la clasificación por cambio (<0,67 y >1,5) y la intensidad de la señal (>150), para identificar cambios sólidos, y se generó una metaclasificación de proteínas. La intensidad de señal relativa de las citoquinas indicadas y los datos de enriquecimiento funcional de Gene Ontology (GO) se presentan en un gráfico de tendencias. El protocolo detallado del ensayo utilizando una matriz de anticuerpos de citoquinas de ratón Quantibody® 4000 se describió anteriormente [32].

Los procedimientos de agotamiento de neutrófilos se han descrito previamente [4, 10]. Los neutrófilos se agotaron 24 h antes de la primera inyección de suero mediante inyección ip de 0,3 mg de anticuerpo anti-Ly6G de ratón o control de isotipo (InVivoPlus anti-Ly6G de ratón, 1A8; BE0075-1, Bioxcell, NH, EE. UU.) cada 3 días. Las inyecciones de suero y anticuerpo anti-ly6G continuaron durante 4 semanas hasta las pruebas de comportamiento. Los niveles de neutrófilos periféricos se mantuvieron muy bajos, lo que se confirmó mediante un ensayo de inmunofluorescencia después de pruebas de comportamiento. El procedimiento de neutrófilos fue continuo para eliminar posibles efectos de rebote.

Las concentraciones de CXCL1, CCL3, CXCL16, CXCL9, HGF, FetuinA, EGF, FGF2, IL-22, TGFB1 y VEGF-A (Beijing 4A Biotech) tanto en suero como en el hipocampo se midieron como se describió anteriormente [29, 30]. . Las muestras de sangre se centrifugaron a 4 °C (a 4000 × g durante 15 minutos) y los sueros se transfirieron a otro conjunto de tubos. Los hipocampos se homogeneizaron en tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 137 mM, NP40 al 1 %, glicerol al 10 %, PMSF 1 mM, aprotinina 1 μl/ml, leupeptina 1 μg/ml y sodio 0,5 mM. vanadato).

Se cultivaron células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón (MBEC, bEnd.3, Procell, CL-0598, Wuhan, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las MBEC se cultivaron en suero bovino fetal al 10%/medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y penicilina-estreptomicina al 1% (Life Technologies, Inc.) en matraces T75 sin recubrimiento a 37 °C y CO2 al 5%. Los cambios completos de medios se realizaron cada dos días. Los MBEC se pasaron utilizando un tratamiento con tripsina al 0,25% durante 1 min a 37 °C. Se cultivaron un total de 10.000 células/cm2 en medio libre de suero durante 24 h y luego se trataron con suero (20 μL), anticuerpo anti-VEGF-A (2 μg) y proteína VEGF-A (20 ng/mL) durante 24 h. h (CME0014, Beijing 4A Biotech).

Para la desactivación CRISPR/Cas9 del gen Cdk5 murino en células bEnd.3, se utilizaron los ARN guía pequeños (ARNsg): sgCDK5#1: CAGGCTGGATGATGACGATG; sgCDK5#2: CCGGGAAACTCATGAGATTG. Las secuencias de sgRNA se verificaron en la herramienta en línea del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Las secuencias de sgRNA se clonaron en nuestro vector pSB-CRISPR construido previamente como se describió anteriormente [33]. La eficacia de las herramientas del vector pSB-CRISPR se identificó mediante transferencia Western con un anticuerpo anti-Cdk5 específico.

Las proteínas totales se extrajeron de células bEnd.3 cultivadas y tejidos cerebrales utilizando un tampón de lisis de proteínas (P0013C, Beyotime), que contenía inhibidores de fosfatasa al 1% (Sigma-Aldrich) y un cóctel de inhibidores de proteasa al 1% (Sigma-Aldrich) y se centrifugaron a 12.000 × g (30 min, 4 °C). La concentración de proteína total se determinó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime, P0012) y se ajustó a 3,5 mg/ml. Se separó un total de 30 μg de proteína mediante SDS-PAGE al 4-10% y se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se bloqueó con solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBST) que contenía 5% de leche y se analizó usando anticuerpos monoclonales contra Ki67 (1:2000, SolA15; eBioscience), Cdk5 (1:2000, DC 17; Santa Cruz), p-Cdk5 (1:2000, C-7; Santa Cruz), receptor 1 anti-glutamato de ratón (1:2000; ab183797, Abcam), anti-sinaptofisina de ratón (1:2000; S5768, Sigma-Aldrich), anti-sinaptofisina de ratón (1:2000; S5768, Sigma-Aldrich) -PSD95 (1:2000; ab13552, Abcam), Tau total (D1M9X, 1:2000, 46687, Cell Signaling Technology), fosfo-Tau Ser199/202 (1:2000, AB9674; Sigma-Aldrich) y anti-β de conejo -actina (1:2000, 4970; tecnología de señalización celular). Las transferencias se escanearon utilizando el sistema Image Quant Las4000mini. Se utilizó el software ImageJ (NIH) para la intensidad media de las bandas.

A los ratones APP/PS1 se les inyectó por vía intraperitoneal 2 μg/kg/d de VEGF-A de ratón recombinante o solución salina durante 3 días como se describió anteriormente con una ligera modificación [34]. Se inyectó AAV-BR1-CMV-mCdk5-P2A-EGFP (BR1-mCdk5) o AAV-BR1-CMV-EGFP (BR1-CON) recombinante sistemático en ratones APP/PS1 de 30 semanas de edad (7,5 meses de edad) a través de la vena de la cola (mCdk5; 1,0 × 1012 partículas genómicas/ratón). Se realizó tratamiento adicional, como inyección de suero, 2 semanas después de la inyección de AAV. El AAV fue producido mediante un sistema de transfección de triple plásmido según estudios previos [35]. En resumen, un plásmido contiene la cápside BR1, un segundo plásmido comprende el gen Cdk5 flanqueado por ITR y un tercer plásmido proporciona genes auxiliares.

Las células endoteliales primarias del hipocampo se aislaron como se describió anteriormente [36]. Brevemente, los hipocampos de ratones APP/PS1 tratados con BR1-mCdk5 o BR1-CON se picaron y se digirieron durante 30 minutos a 37 °C con FBS al 2 % (vol/vol) en PBS que contenía 400 U/ml de colagenasa. Después de la digestión enzimática, el tejido se sedimentó mediante centrifugación a 300 x ga 4 ° C durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. Los sedimentos celulares se resuspendieron en FBS al 2 % (vol/vol) en PBS que contenía ADNasa I (0,5 mg/ml) y se añadieron suavemente suspensiones de células individuales encima de Percoll al 22 % y se centrifugaron a 560 x g a 4 °C durante 10 min para obtener las células vasculares en el fondo del tubo. Las células purificadas se analizaron en un citómetro de flujo FACS Calibur (BD influxTM, Nueva Jersey, EE. UU.) utilizando un anticuerpo anti-CD31-PE (0,25 mg/106 células; B&D).

Se aislaron células endoteliales del hipocampo de ratón como se describe anteriormente [36]. El ARN total de las células endoteliales del hipocampo se aisló utilizando RNAiso Plus (Sangon Biotech, Shanghai, China). El ADNc se sintetizó utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc GoScriptTM (Promega, Madison, WI, EE. UU.). La expresión de ARNm específicos se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia (RT-PCR). Las PCR cuantitativas se realizaron utilizando TransStart Tip Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Beijing, China) por triplicado para cada muestra. Los detalles de las secuencias de cebadores son los siguientes:

Cdk5 (adelante), 59-CAATGCAGAAATACGAGAAACTGG-39;

Cdk5 (inversa), 59-CTTTGAGTAGACAGATCTCCCG-39;

Cxcl1 (adelante), 59-ACCGAAGTCATAGCCACACTC-39;

Cxcl1 (reverso), 59-CTCCGTTACTTGGGGACACC-39.

La permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE) se evaluó mediante tinción con azul de Evans, como se describió anteriormente con ligeras modificaciones [30]. Brevemente, se inyectó por vía intravenosa una solución al 2 % de colorante azul de Evans (E2129; Sigma-Aldrich) en solución salina al 0,9 % en los ratones APP/PS1 a través de la vena de la cola a una dosis de 2 ml/kg un día después de la última inyección de VEGF-A. inyección. Dos horas más tarde, todos los ratones fueron anestesiados y perfundidos transcardialmente con solución salina fría al 0,9%. Para detectar la fuga de azul de Evans, se homogeneizaron muestras de tejido cerebral en dimetilformamida al 99% y se incubaron en un baño de agua a 50 °C durante 48 h. El sobrenadante se recogió después de la centrifugación a 12.000 x g (30 min, 4 °C) y la absorbancia de la muestra se midió a 620 nm utilizando un lector de microplacas.

Se prepararon cortes coronales de cerebro del hipocampo (300 μm de espesor) a partir de ratones APP/PS1 machos posnatales de 5 a 6 meses de edad y sus compañeros de camada WT utilizando un vibratomo (Leica VT1000) en una solución previamente enfriada que contenía (en mM) 110 cloruro de colina, 7 MgCl2·6H2O, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2·H2O, 1,3 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 20 glucosa, saturado con 95% O2 y 5% CO2. Las rodajas se transfirieron inmediatamente a líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) a 35 °C durante 30 minutos y luego se transfirieron a una cámara de grabación. El registro de ACSF que contiene (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2·H2O, 1,3 MgCl2·6H2O, 1,3 NaH2PO4, 25 NaHCO3 y 10 glucosa. Todas las soluciones de ACSF deben saturarse con carburógeno (95 % O2/5 % CO2) antes de su uso para garantizar una amortiguación de pH estable (pH 7,3) y una oxigenación adecuada. Se obtuvieron registros de pinzamiento de células enteras del soma de las neuronas piramidales de la circunvolución dentada (DG) bajo un microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC) infrarrojo (IR) (ECLIPSE FN1, Nikon). Para registrar mEPSC, los potenciales de retención se mantuvieron a -70 mV, el receptor GABAA y los potenciales de acción se bloquearon con metioduro de bicuculina (BMI) 20 µM y tetrodotoxina (TTX) 1 µM, respectivamente. Se llenaron pipetas de vidrio con una solución interna que contenía (en mM) 100 CsMeSO4, 25,5 CsCl, 10 HEPES, 8 NaCl, 0,25 EGTA, 10 glucosa, 4 MgATP y 0,3 Na3GTP (pH 7,3, 285 mOsm). Los datos se digitalizaron a 10 kHz, se filtraron a 1 kHz y se registraron utilizando un amplificador multiClamp 700B y Digidata 1500B con el software pClamp11.2 (Molecular Devices). Los datos se recopilaron cuando la resistencia de la serie fluctuó dentro del 20% de los valores iniciales y se analizaron utilizando el Mini Analysis Program (Synaptosoft) y el software pClamp 11.2 (Molecular Devices). El método de electrofisiología se realizó de acuerdo con los estudios informados anteriormente [37, 38].

Se recogieron mediante punción cardíaca en tubos recubiertos con heparina un total de 100 µl de muestras de sangre completa de ratones APP/PS1 de tipo ancho y de ratones APP/PS1 inyectados con suero. Todas las muestras de sangre periférica se analizaron con un analizador de hematología automático (Sysmex, XT-2000i, Sysmex Corporation, Japón). Se analizaron los siguientes parámetros sanguíneos: recuento de glóbulos blancos (WBC), recuento de glóbulos rojos (RBC), neutrófilos (Neu), linfocitos (Lym), monocitos (Mon), eosinófilos (Eos), basófilos (Bas), hemoglobina ( HGB), hematocrito (HCT), volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), recuento de plaquetas (PLT), volumen plaquetario medio (MPV), ancho de distribución de plaquetas (PDW).

Todos los resultados representan al menos tres experimentos independientes y se expresan como media ± SEM. Para el análisis estadístico se realizó una prueba t de Student bilateral no pareada (entre dos grupos) o un ANOVA unidireccional o bidireccional (pruebas de comparación de Bonferroni o LSD) o una prueba de Kolmogorov-Smirnov. Se realizó ANOVA repetido de dos vías en los resultados de la prueba MWM. Se utilizó ANOVA unidireccional (homogeneidad de varianza igual) o Dunnett T3 (homogeneidad de varianza desigual) para el análisis del perfil hematológico. Se asumió que la distribución de los datos era normal; esto también se probó con gráficos QQ o histogramas. Los análisis y gráficos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 8.0 (GraphPad 8.0). P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

La inmunidad innata se asocia con la patología de la EA [39,40,41]. Para investigar la respuesta de las células inmunes innatas al tratamiento con suero natural en ratones APP/PS1, utilizamos citometría de flujo para analizar las actividades de los subconjuntos de células inmunes CD45+ y CD45+/CD11b+ en células mononucleares de sangre periférica (PBMC, Fig. 1A, B; Suplementario). Fig. 1A, B) y suspensiones de células cerebrales (Fig. 1G, H). Curiosamente, después del tratamiento con suero, hubo un aumento en el número de células inmunes CD45+, pero una disminución en los neutrófilos CD11b+Ly6GhiLy6Clo, tanto en la sangre periférica (Fig. 1C, D, F) como en el cerebro (Fig. 1I, J, L) en el modelo de enfermedad. En particular, la inyección de suero elevó significativamente el recuento de células de monocitos CD11b+/Ly6Chi/Ly6Glo (Fig. 1C, E), lo que es consistente con los resultados reflejados por CD11b+/CD45hi (Fig. 1B, C complementaria). Inesperadamente, observamos resultados inconsistentes entre el número de monocitos CD11b+/Ly6Chi/Ly6Glo (Fig. 1I, K) y monocitos CD11b+/CD45hi (Fig. 1E, F suplementaria) en cerebros de ratón APP/PS1 tratados con suero. Dado que los neutrófilos pueden producir trampas extracelulares de neutrófilos (NET), analizamos la presencia de NET en el cerebro de ratones con EA mediante tinción inmunofluorescente anti-neutrófilo elastasa (NE) o anti-mieloperoxidasa (MPO). De hecho, observamos neutrófilos acompañados de NET en el parénquima, que se localizan principalmente alrededor del ventrículo cerebral, el plexo coroideo, las leptomeninges, la placa Aβ y los vasos corticales (Fig. 2A-D). Consistentemente, el tratamiento con anticuerpos Ly6G eliminó los neutrófilos NE+ o MPO+ adyacentes al hipocampo, los espacios ventriculares y las leptomeninges en ratones AD (Fig. 2E, F). A continuación, investigamos el fenotipo de la infiltración de neutrófilos en un modelo de ratón con EA mediante análisis de citometría de flujo. El número de subconjuntos de neutrófilos senescentes Ly6G+/CXCR4hi/CD62Llo hiperreactivos dañinos aumentó significativamente en los cerebros de ratones APP/PS1 en comparación con los controles WT, mientras que estos efectos se previnieron con suero o tratamiento con anticuerpos neutralizantes Ly6G (Fig. 2G, H). En conjunto, estos resultados sugieren que la inyección de suero en ratones con EA disminuyó la cantidad de neutrófilos periféricos y evitó la migración del subconjunto de neutrófilos hiperreactivos al cerebro.

Estrategia de selección de citometría de flujo de células inmunes (P1), células individuales (P2), leucocitos CD45+ (P3) y monocitos CD45hi/CD11b+ (P4) en PBMC (A, B) y el cerebro (G, H). Las flechas rojas en AB y GH representan el subconjunto P2 basado en P1, el subconjunto P3 basado en P2 y el subconjunto P4 basado en P3. Los monocitos C tienen poblaciones claramente diferentes según la expresión de Ly6C y Ly6G. D – F Análisis de citometría de flujo de las frecuencias de leucocitos CD45+ (P3), monocitos Ly6Chi/Ly6Glo (indicados por la puerta azul en C) y neutrófilos Ly6Ghi/Ly6Clo (indicados por la puerta roja en C) en las PBMC de PBS y suero -ratones APP/PS1 tratados. I Los monocitos tienen poblaciones claramente diferentes según la expresión de Ly6C. J–L Análisis por citometría de flujo de las frecuencias de leucocitos CD45+ (P3), monocitos Ly6Chi/Ly6Glo (indicados por la puerta azul en I) y neutrófilos Ly6Clo/Ly6Ghi (indicados por la puerta roja en I) en los cerebros de PBS- y ratones APP/PS1 de 8 a 9 meses de edad tratados con suero (los datos se presentan como la media ± sem; prueba t de Student de dos colas no apareada, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 ; n = 5-6 por grupo).

Imágenes confocales representativas de leucocitos NE+ (glóbulos rojos) en 3V (A), alrededor del área del hipocampo (paneles izquierdos en B) y el plexo coroideo (paneles derechos en B). Leucocitos MPO+ (glóbulos rojos) en las meninges y el parénquima donde se deposita la placa Aβ (tinción verde) (C) y alrededor de los vasos cerebrales (paneles derechos en D) en ratones APP/PS1 de 8 a 9 meses de edad. Los vasos cerebrales se identificaron mediante tinción de Hoechst en 3D utilizando el software Zen. Cuantificación del número de células NE+ (E) y MPO+ (F) en el hipocampo, 3V, vasos sanguíneos y piamadre en ratones APP/PS1 tratados con anticuerpo anti-Ly6G o anticuerpo de control de isotipo (los datos se presentan como la media ± sem ; prueba t de Student de dos colas no apareada, n = 5–6; **p < 0,01; ***p < 0,001). G, H Análisis de citometría de flujo de neutrófilos hiperreactivos que se infiltran en el cerebro, según lo refleja la tinción CXCR4hi/CD62Llo en ratones APP/PS1 tratados con suero o anticuerpo anti-Ly6G y controles WT (n = 4–5). ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. ***p < 0,001. Hipocampo de la cadera, tercer ventrículo 3V, giro dentado DG, plexo coroideo CP, barra de escala: 20 μm en A y B; 50 μm en C y D.

El microambiente inmunológico circulante juega un papel importante en la homeostasis cerebral en la EA [40,41,42]. Demostramos que la inyección de suero redujo la cantidad de neutrófilos periféricos y cerebrales en ratones transgénicos APP/PS1. Sin embargo, aún no está claro cómo los neutrófilos periféricos reducidos pueden atenuar su infiltración en el parénquima en ratones con EA. Por lo tanto, primero analizamos los perfiles de citocinas del suero de ratones WT + PBS, WT + suero, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + suero utilizando una matriz de citocinas de ratón. La agrupación jerárquica no supervisada basada en proteínas expresadas diferencialmente (DEP) indicó una red de expresión de proteínas distinta inducida por el suero (Fig. 3A, B). Las 82 proteínas mejor clasificadas se enumeran en la Tabla complementaria 1. El análisis de ontología genética (GO) mostró un enriquecimiento significativo de proteínas involucradas principalmente en la migración de neutrófilos, la migración de leucocitos y la quimiotaxis (Fig. 3C, D). El análisis de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) utilizando las 82 proteínas mejor clasificadas (23 reguladas negativamente y 59 reguladas positivamente) reveló una red de interacciones entre receptores de citocinas y vías de señalización de quimiocinas (Figuras complementarias 2A, B).

El análisis de la matriz de anticuerpos de citoquinas de ratón se realizó en el suero de ratones APP/PS1 tratados con PBS o suero (de 8 a 9 meses de edad) y en ratones WT de la misma edad tratados con PBS o suero. A, B Se detectó expresión de citocinas reguladas a la baja (azul) y no reguladas (rojo) en el suero entre ratones WT + PBS y APP/PS1 + PBS y entre ratones APP/PS1 + PBS y APP/PS1+Suero. Análisis de enriquecimiento de ontología genética (proceso biológico) de 23 citocinas reguladas negativamente (C) y 59 citocinas reguladas positivamente (D) en grupos APP/PS1+Suero vs. APP/PS1 + PBS. E Diagrama de Venn que muestra las citoquinas superpuestas en el suero de los cuatro grupos. El azul representa los grupos APP/PS1 + PBS frente a WT + PBS; el rojo representa los grupos APP/PS1 + Suero versus WT + PBS; y el verde representa los grupos APP/PS1 + Suero vs. APP/PS1 + PBS. F Análisis de mapa de calor de expresión génica de agrupamiento no supervisado que muestra las 36 citocinas superpuestas entre el suero de ratones WT + PBS, WT + suero, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + suero.

Además, se identificaron 36 DEP (Tabla complementaria 2) en el suero de ratones WT + PBS, WT + Suero, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + Suero mediante un diagrama de Venn (Fig. 3E) y un mapa de calor (Fig. 3F). Se identificaron quimiocinas, factores de crecimiento y citocinas a partir de las 36 DEP, incluidas CXCL1, CCL3, CXCL16, CXCL9, HGF, FetuinA, EGF, FGF2, IL-22 y TGFB1. Estos factores se enriquecen significativamente en la migración y la quimiotaxis de neutrófilos/leucocitos. Confirmamos además los resultados utilizando kits de ELISA en el suero y el cerebro de ratones WT + PBS, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + suero (Fig. 4A-J).

Nuestros datos mostraron que los niveles de CXCL1 (A), CCL3 (B), CXCL16 (C) y FetuinA (F) aumentaron significativamente, y los niveles de CXCL9, HGF, IL-22 y TGFB1 disminuyeron significativamente en el suero. de ratones APP / PS1 (8 a 9 meses de edad) en relación con los de los ratones WT de la misma edad (D, E, I y J). Sin embargo, estas alteraciones aumentadas se restauraron a los niveles detectados en ratones WT + PBS después del tratamiento con suero. No se observaron diferencias obvias en los niveles de EGF y FGF2 en el suero de ratones WT + PBS, APP/PS1 + PBS y APP/PS1+suero (G, H). La red de interacción proteína-proteína (PPI) basada en la herramienta en línea STRING que utiliza las 82 proteínas mejor clasificadas produjo la red más sólida en torno a la señalización de citocinas quimiotácticas y factores angiogénicos (CXCL1 y VEGF-A). Las concentraciones medias se expresan en pg/ml de suero. ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. Los datos se presentan como media ± sem; ns no significativo; n = 6 por grupo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

De acuerdo con los resultados de la prueba de matriz de anticuerpos contra citocinas, los niveles de quimiocinas CXCL1, CCL3 y CXCL16 asociadas con la migración de neutrófilos aumentaron significativamente en los cerebros de ratones APP/PS1 + PBS. Después de un tratamiento con suero de tipo salvaje de 4 a 6 semanas de edad, el aumento de la expresión de estas tres quimiocinas se normalizó tanto en la periferia como en el cerebro, alcanzando los niveles de ratones WT de la misma edad (9 meses de edad) (Fig. 4A- C; Figura complementaria 3A – C). En particular, el análisis de la vía de ingenio (IPA) utilizando las proteínas mejor clasificadas produjo la red más fuerte alrededor de la señalización de CXCL1 y VEGF-A (Fig. 4K). Además, realizamos la prueba utilizando un analizador de hematología en ratones de tipo ancho, ratones APP/PS1 tratados con o sin suero. De acuerdo con los datos de las pruebas de citometría de flujo (Fig. 1E; Fig. S1C), los datos hematológicos mostraron que la inyección de suero disminuyó significativamente la cantidad de neutrófilos y aumentó los recuentos de monocitos (Tabla complementaria 3). Estos resultados indican que las quimiocinas circulantes sistémicas derivadas del suero pueden modular la infiltración de neutrófilos proinflamatorios en el cerebro en un modelo de ratón con EA.

A continuación, investigamos el mecanismo molecular subyacente a la adhesión/infiltración de neutrófilos en ratones APP/PS1. Nos centramos en la citoquina CXCL1, una quimiocina atrayente de neutrófilos en el accidente cerebrovascular isquémico [43], la esclerosis múltiple [44] y múltiples modelos murinos de neuroinflamación [45,46,47]. La eliminación de Cdk5 específica del endotelio aumentó la expresión de CXCL1 y condujo a astrogliosis progresiva en la epilepsia [R]. De acuerdo con el estudio anterior, encontramos una relación negativa entre los niveles de CXCL1 y los niveles de Cdk5/pCdk5 en células bEnd.3 después del tratamiento con Aβ o suero (Fig. 5A; Fig. Suplementaria 4A, B). El análisis de colocalización confirmó que las proteínas Cdk5, pCdk5 y CXCL1 existían en el citoplasma de las células endoteliales microvasculares del cerebro (Fig. 4C, D complementaria). Sin embargo, la distribución de Cdk5 y pCdk5 obviamente difería de la distribución de CXCL1 en el citoplasma (Figura complementaria 4E, F).

A Imágenes representativas de la expresión de CDK, pCDK y CXCL1 en células bEnd.3 (CD31+). Barra de escala: 10 μm. B Transferencia Western (WB) para marcadores de proliferación celular Ki67, Cdk5 fosforilada y Cdk5, en células bEnd.3 se trataron con Aβ (2 μM), suero (20 μL), anticuerpos anti-VEGF-A (2 μg) y proteína VEGF-A recombinante (20 ng/ml). C Cuantificación de la banda para las proteínas Ki67, pCdk5 y Cdk5 mediante análisis de transferencia Western; n = 5 por grupo. D análisis ELISA para niveles de CXCL1 relacionados con C en el sobrenadante; n = 6 por grupo. El inhibidor de E Cdk5 roscovitina (20 μM) inhibe la fosforilación de Cdk5 inducida por VEGF-A en células bEnd.3; n = 3–4 por grupo. F Efecto de la desactivación de CDK5 utilizando un sgRNA sobre la expresión de CXCL1 en células bEnd.3 con o sin estimulación con VEGF-A; n = 6 por grupo. G, H Imágenes representativas y cuantificación de la angiogénesis cerebral (lectina+) en ratones WT, APP/PS1, ratones APP/PS1 tratados con anticuerpos anti-Ly6G o proteína recombinante VEGF-A; n = 8 ratones por grupo, se analizaron y promediaron como valor 12 campos de imágenes de 5 cortes de cerebro por animal; Barra de escala: 50 μm en G. I – J Imágenes representativas y cuantificación de la adhesión de neutrófilos teñidas por anticuerpo anti-MPO en capilares corticales en ratones APP/PS1 (bilineales blancos; los vasos identificados según la herramienta Z-Stack); ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. ns no significativo; n = 6 ratones por grupo, se analizaron y promediaron como valor 10 campos de imágenes de 4 cortes de cerebro por animal; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 para todos. Barra de escala: 20 μm en I. Los datos muestran los tres experimentos in vitro separados que produjeron resultados comparables.

Además, encontramos que VEGF-A era otra molécula clave de IPA después del tratamiento con suero (Fig. 4K), y la exposición al suero aumentó los niveles circulantes de VEGF-A en ratones APP/PS1 (Fig. 5 complementaria). Además, la señalización de VEGF-A modula las funciones cerebrales en la progresión del envejecimiento [22]. La inhibición o silenciamiento de Cdk5 redujo la migración de células endoteliales y la angiogénesis al interferir con el citoesqueleto de actina [49, 50]. Consistentemente, nuestros datos mostraron que la disminución de la proliferación de células endoteliales fue paralela a la baja expresión de Cdk5 después del tratamiento con Aβ in vitro (Fig. 5B, C), lo que implica un vínculo potencial entre Cdk5 y la angiogénesis. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que VEGF-A puede afectar la expresión de CXCL1 a través de la señalización de Cdk5. Primero, encontramos que el suero no logró prevenir las disminuciones inducidas por Aβ en la expresión y fosforilación de Cdk5 en células bEnd.3 después del tratamiento con anticuerpo VEGF-A (Fig. 5B, C). De manera similar a los efectos beneficiosos del suero, VEGF-A también previno significativamente el aumento inducido por Aβ en la expresión de CXCL1 (Fig. 5D). Para estudiar más a fondo cómo VEGF-A mediaba la baja expresión de CXCL1, examinamos la actividad de Cdk5 mediante el uso de roscovitina, un inhibidor de Cdk5 (Fig. 5E). Descubrimos que la roscovitina atenuó el efecto inhibidor de VEGF-A en la expresión de CXCL1 (Figuras complementarias 6A a G). De acuerdo con estos resultados, la eliminación del gen endotelial Cdk5 en células bEnd.3 mediante la edición del gen CRISPR-Cas9 también evitó la supresión de CXCL1 mediada por VEGF-A, induciendo en su lugar un aumento triple en los niveles de CXCL1 en el sobrenadante (Fig. 5F).

La adhesión de neutrófilos en los capilares cerebrales reduce el flujo sanguíneo cortical, lo que produce anomalías vasculares y exacerba la patología cerebral en múltiples modelos de ratón con enfermedad de Alzheimer [10, 11]. Observamos que el suero promovió la angiogénesis y disminuyó los segmentos capilares en ratones APP/PS1 (Fig. 5G, H). Para investigar el papel de la adhesión de neutrófilos en los capilares corticales, administramos anticuerpos neutralizantes Ly6G para agotar los neutrófilos periféricos en ratones APP/PS1. Nuestros resultados mostraron que el anticuerpo Ly6G imitó los efectos beneficiosos del suero al aumentar la cantidad de capilares (Fig. 5G, H). De hecho, el tratamiento con anticuerpo Ly6G condujo a una reducción aproximada del 90 % en el número de neutrófilos MPO+ adyacentes a los capilares corticales (Fig. 5I, J; Fig. 2D, F). Estos datos sugieren que el suero puede aumentar la densidad capilar cerebral al prevenir la adhesión/infiltración de neutrófilos.

Luego probamos la hipótesis de que el VEGF-A derivado del suero era necesario para el bloqueo de la adhesión de neutrófilos y la pérdida de capilares cerebrales in vivo. Por lo tanto, aplicamos proteína VEGF-A recombinante a ratones APP/PS1 y descubrimos que VEGF-A podría promover la actividad de Cdk5 y pCdk5 (Fig. 7A – F, I – N complementaria), aumentar la angiogénesis cerebral y disminuir los pequeños segmentos capilares (Fig. 5G, H), seguido de una disminución en la adhesión de neutrófilos en ratones APP/PS1 (Fig. 5I, J). De manera similar, el anticuerpo neutralizante Ly6G mostró beneficios similares al suero y la proteína VEGF-A en la cantidad de capilares y la adhesión de neutrófilos adyacentes a los capilares corticales (Fig. 5I, J). En particular, no observamos ningún empeoramiento adicional de la permeabilidad e integridad de la BBB en los cerebros de ratones APP/PS1 tratados con VEGF-A en comparación con ratones APP/PS1 tratados con PBS (Figuras complementarias 8A-C). En conjunto, estos resultados indican que el VEGF-A derivado del suero suprime la expresión de CXCL1 a través de la actividad de Cdk5, lo que da como resultado la inhibición del reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del ratón con EA.

A continuación, para determinar el papel de los neutrófilos migratorios en el cerebro en el deterioro cognitivo, evaluamos el aprendizaje espacial y el rendimiento de la memoria mediante el condicionamiento contextual del miedo y las pruebas del laberinto acuático de Morris. Durante el entrenamiento de acondicionamiento del miedo, todos los grupos mostraron un tiempo de congelación inicial comparable (Figura complementaria 9A). Sin embargo, encontramos que los comportamientos de congelación aumentaron significativamente durante la prueba de memoria de miedo contextual (Figura 9B complementaria), pero no con indicaciones (Figura 9C complementaria) en ratones APP/PS1 después del agotamiento de neutrófilos. El rendimiento fue similar al de los ratones WT y a los ratones APP/PS1 tratados con suero (Figura complementaria 9B). En la prueba MWM, la administración del anticuerpo Ly6G en ratones APP/PS1 también mejoró el rendimiento para la ubicación oculta de la plataforma durante la fase de adquisición (Figura complementaria 9D). Durante la fase de sonda espacial, los ratones APP/PS1 con agotamiento de neutrófilos pasaron más tiempo y viajaron mayores distancias en el cuadrante objetivo (Figura complementaria 9E, F; aumentos del 46,7% y 53,4% para el tiempo y la distancia en el cuadrante, respectivamente) y tuvo un número significativamente mayor de pases a través de la plataforma que los ratones APP/PS1 (Figura complementaria 9G; aumento de 2 veces). Además, no observamos diferencias obvias en la velocidad de natación de todos los grupos (Figura complementaria 9H). La eficiencia de la eliminación en la sangre periférica, el cerebro y las meninges se confirmó mediante análisis de citometría de flujo y tinción por inmunofluorescencia (Fig. 2A – F; Fig. Suplementaria 10A – F; Fig. Suplementaria 11A – E). Sin embargo, la administración del anticuerpo Ly6G no tuvo influencia en el porcentaje de linfocitos T CD3+ (Figura complementaria 11F-I), ni en las condiciones de salud en ratones APP/PS1, como lo reflejan las capacidades exploratorias y la velocidad de movimiento en la OFT (Figura complementaria .11J–L). Estos resultados demuestran que el tratamiento con el anticuerpo Ly6G tiene efectos beneficiosos sobre el comportamiento de la memoria en ratones APP/PS1.

Para determinar aún más el papel de la señalización de Cdk5 en la infiltración de neutrófilos y los déficits de memoria en el cerebro APP/PS1, utilizamos AAV2-BR1-CMV-mCdk5-P2A-EGFP (BR1-mCdk5) para inducir la sobreexpresión de Cdk5 endotelial cerebral y llevamos a cabo la evaluación conductual. prueba de acuerdo con el esquema experimental (Fig. 6A – D). La RT-PCR confirmó que el ARNm de Cdk5 aumentó en las células endoteliales del cerebro después de la administración de AAV (Fig. 6E, F). Se observaron aumentos similares en los niveles de proteína Cdk5 en el hipocampo mediante tinción inmunofluorescente (Fig. 12A, B complementaria).

Un esquema de los detalles experimentales. La expresión sistemática de AAV-mCdk5 se determinó en ratones APP/PS1 de 30 semanas de edad (alrededor de 7,5 meses). Después de 2 semanas (8 meses de edad), a ratones transgénicos APP/PS1 machos tratados con AAV se les inyectó por vía intravenosa 9 veces 200 µl de suero de ratones C57BL/6 de 4 semanas de edad cada 3 días. Después de la última inyección de suero se realizaron análisis de comportamiento, incluidas las pruebas de condicionamiento del miedo (FCT) y la prueba MWM. Representación esquemática de construcciones de AAV2-BR1 que indican las repeticiones terminales invertidas (ITR) en ambos extremos y mCdk5 impulsado por el promotor de CMV con EGFP (BR1-mCdk5) o EGFP impulsado por el promotor de CMV (BR1-CON). B – D Diagrama esquemático del procedimiento de condicionamiento del miedo. B Jornada de formación (contexto I); C Día de la prueba contextual (contexto I); D Día del examen con indicaciones (contexto II). E, F Los niveles relativos de ARNm de Cdk5 y CXCL1 en células endoteliales primarias del hipocampo se evaluaron en ratones APP/PS1 inyectados con BR1-mCdk5 y BR1-CON a las 32 semanas de edad (n = 4 por grupo). Imágenes confocales representativas de la expresión de CXCL1 en microvasos cerebrales (verde, G) y neutrófilos (rojo, H) en los ventrículos laterales de ratones APP/PS1 inyectados con BR1-mCdk5 o BR1-CON a través de la vena de la cola. Barra de escala: 10 μm en G; 50 μm en H. I, J Análisis de citometría de flujo representativo y cuantificación de neutrófilos (Ly6Ghi/Ly6Clo) en el cerebro de ratones APP/PS1 inyectados con BR1-Cdk5 o BR1-CON (n = 4–5 ratones por grupo). K Mapa de calor representativo de la trayectoria de escape en la fase de sonda de la tarea MWM. Se evaluaron ratones APP/PS1 inyectados con BR1-mCdk5 o BR1-CON (8 meses de edad) y ratones WT de la misma edad en la tarea MWM. M, N La frecuencia y el tiempo pasado en el cuadrante objetivo (TQ) en los grupos. O Prueba de congelación contextual. n = 7 o 10 ratones por grupo para la prueba de comportamiento. Todos los datos se muestran como media ± sem; ANOVA bidireccional repetido, pruebas de comparación múltiple de Bonferroni; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001.

De acuerdo con los resultados in vitro, la expresión de CXCL1 en los vasos cerebrales disminuyó después de la sobreexpresión de Cdk5 en ratones APP/PS1, como lo muestra la tinción inmunofluorescente (Fig. 6G). Además, la sobreexpresión de Cdk5 endotelial resultó en una disminución de los neutrófilos migratorios al cerebro (Fig. 6H-J), acortó la latencia de escape (Fig. 6L) y aumentó la frecuencia de los pasos a través de la plataforma (Fig. 6K, M). y la duración en el cuadrante objetivo en la prueba MWM (Fig. 6N), y un mayor tiempo de congelación en la prueba de memoria contextual pero no con indicaciones (Fig. 6O). Por lo tanto, estos resultados son en gran medida consistentes con los datos in vitro y demuestran que la sobreexpresión de Cdk5 disminuye la secreción de CXCL1 en las células endoteliales del cerebro.

En conjunto, nuestros resultados respaldan que la señalización mejorada de Cdk5 inhibe la infiltración de neutrófilos y rescata los déficits de memoria, lo que sugiere los efectos beneficiosos del tratamiento con suero en un modelo de ratón con EA.

La pérdida sináptica suele detectarse tempranamente en pacientes con EA [51] y en modelos de ratón de la enfermedad [52]. Por lo tanto, a continuación determinamos el efecto del suero sobre el marcador presináptico sinaptofisina y el receptor AMPA GluA1. De acuerdo con estudios previos [53, 54], el modelo de ratón macho APP/PS1 de 8 a 9 meses mostró una disminución significativa en la expresión de sinaptofisina y GluA1 en DG y CA3, pero no en CA1 del hipocampo, en comparación con las observaciones. en los controles WT de la misma edad (Fig. 7A-E; para sinaptofisina, disminuciones de 32,6% y 47,8% en DG y CA3, respectivamente; disminuciones de 42,5% en CA3 para GluA1). Después de la sobreexpresión de Cdk5 inducida por virus, encontramos que las disminuciones en las proteínas sinápticas se restauraron significativamente en ratones APP/PS1 (Fig. 7E, F), lo que concuerda con los resultados en ratones APP/PS1 tratados con suero y anticuerpo Ly6G (suplementario). Figuras 13A–H). Además, no se observaron diferencias en la expresión de GluA1, sinaptofisina o PSD95 en la corteza en los diferentes grupos mediante análisis de transferencia Western (Figura complementaria 13I, J).

Imágenes confocales representativas (A – D) y cuantificación (E) de sinaptofisina y GluA1 en CA1, CA3 y DG en el hipocampo de ratones WT, ratones APP/PS1 tratados con AAV-Cdk5 y los controles. IR: inmunorreactividad; Barra de escala, 100 μm. F Análisis de transferencia Western de proteínas sinápticas, incluidas GluA1, PSD95 y sinaptofisina en el hipocampo. Los datos se representan como la media ± sem; pruebas de comparación múltiple de ANOVA unidireccional y LSD, n = 4 ratones por grupo (se analizaron y promediaron como valor más de 10 campos de imágenes de 5 cortes de cerebro por animal); *p < 0,05; **p < 0,01, ns no significativo. G Esquema de los experimentos en H – K. H Imágenes confocales y reconstrucción 3D de procesos microgliales (Cx3cr1-GFP) que envuelven los puntos GluA1+, se evaluó el porcentaje de puntos envueltos por la microglia. Los datos se representan como la media ± sem; pruebas de comparación múltiple de ANOVA unidireccional y LSD, n = 5 ratones por grupo (se analizaron y promediaron como valor más de 34 microglías de 5 cortes de cerebro por animal); *p < 0,05; **p<0,01. I Puntos engullidos distribuidos dentro de la microglia, la distancia es inferior a 0 μm de la superficie de la microglia; y puntos en contacto distribuidos fuera de la microglia, pero la distancia es inferior a 0,25 μm de la superficie microglial. Los puntos morados se muestran en I (abajo). Se analizó la reconstrucción 3D de los procesos microgliales y los puntos GluA1+ en ratones WT, así como las placas de Aβ (azul) en ratones APP/PS1 y los puntos GluA1 contactados (menos de 0,25 μm) (n = 25–44 células de 7 ratones). . Análisis de K Sholl de microglía reconstruida en 3D (n = 14–21 células de 3 ratones por grupo). *p < 0,05; **p<0,01. Barra de escala: 1 μm en H, I; 5 μm en J, 10 μm en K. L Trazas representativas de mEPSC en neuronas piramidales DG de ratones de tipo ancho, ratones APP/PS1 y ratones APP/PS1 tratados con AAV-Cdk5, barra de escala: 1 s, 20 pA. M Frecuencias promedio de mEPSC. N amplitudes promedio de mEPSC; prueba de Kolmogorov-Smirnov; *p < 0,05; ***p < 0,001; n = 19 o 20 células de 3 ratones/grupo en M y N.

Microglia promueve la poda de sinapsis de una manera dependiente del complemento [52]. La pérdida sináptica observada en ratones con EA puede deberse a un aumento de la fagocitosis microglial [27, 52]. Para probar si la microglía interactúa directamente con las sinapsis neuronales en el presente estudio, investigamos la asociación de la microglía que expresa reporteros fluorescentes con los puntos sinápticos (GluA1+) utilizando imágenes de reconstrucción 3D del hipocampo en ratones APP/PS1 (Fig. 7G). Clasificamos las sinapsis de GluA1+ en dos subconjuntos: puntos envueltos (distribuidos dentro de la microglia con una distancia inferior a 0 μm de la superficie microglial; puntos amarillos en la Fig. 7H; puntos violeta claro en la Fig. 7I) y puntos contactados (distribuidos fuera de la microglia con a una distancia inferior a 0,25 μm de la superficie microglial (puntos morados en la Fig. 7I, a continuación). Nuestros datos revelaron que se rescataron disminuciones significativas en los puntos sinápticos GluA1 + engullidos o contactados por la microglía Cx3cr1GFP en ratones APP/PS1 sobreexpresados ​​con Cdk5 (Fig. 7H-J). El análisis de Sholl mostró que la complejidad reducida de la ramificación microglial en ratones APP/PS1 se normalizó mediante la sobreexpresión de Cdk5 en células endoteliales del cerebro (Fig. 7K).

Para examinar más a fondo si la función sináptica deteriorada en ratones APP/PS1 se rescató después del tratamiento con AAV-Cdk5, examinamos las propiedades sinápticas de las neuronas piramidales en el DG. Los registros de células completas de neuronas piramidales mostraron que la frecuencia, pero no la amplitud, de mEPSC espontánea disminuyó drásticamente en ratones APP/PS1, mientras que estos efectos se restauraron a niveles de tipo amplio después de la sobreexpresión de Cdk5 (Fig. 7L-N). Junto con los datos de la sinapsis de GluA1+, estos datos indicaron que la sobreexpresión de Cdk5 restableció las entradas sinápticas reducidas en las neuronas piramidales DG en ratones APP/PS1.

Como se esperaba, la microglía en ratones APP/PS1 que recibieron anticuerpos isotipo IgG mostró una morfología ameboide, expresó altos niveles de CD68 y mostró volúmenes más pequeños (Figuras complementarias 14A-C). En particular, la sobreexpresión de Cdk5, el suero y el tratamiento con anticuerpos Ly6G no solo aliviaron significativamente la activación excesiva de la microglía (Iba-1+/CD68+), sino que también cambiaron parcialmente la duración del proceso y el volumen de la microglía hacia la forma homeostática (Figuras complementarias 14A-F). . El suero no alteró las distribuciones de Aβ (Figuras complementarias 15A-D) ni Aβ40 y Aβ42 solubles en RIPA y SDS en el cerebro (Figuras complementarias 15E-L), lo que sugiere que estos efectos sobre la microglía son independientes de las placas de Aβ. Además, identificamos los niveles de Tau de fósforo y Tau total en el cerebro después del tratamiento con suero, que no tuvieron influencia en los niveles de Tau total y Tau de fósforo tanto en el hipocampo como en la corteza del cerebro APP/PS1 (Figura complementaria 16A). -D). Además, también se midieron los multímeros de Tau de 140 kDa (banda de alto peso molecular) después de la inyección de suero. De manera similar, los niveles de Tau de alto peso molecular se mantuvieron sin cambios en comparación con los controles (Figuras complementarias 16A-D). En conjunto, nuestros resultados revelaron que la inhibición de la infiltración de neutrófilos por el suero mejoró el deterioro cognitivo, en parte al aliviar la pérdida sináptica y la neuroinflamación en el hipocampo del cerebro APP/PS1.

El sistema inmunológico innato, incluidos los neutrófilos periféricos y la microglía central, desempeña un papel importante en los trastornos neurodegenerativos [4, 6, 39, 55]. Los neutrófilos son las células efectoras clave de la inmunidad innata temprana y contribuyen a la inflamación en el cerebro [10, 56] y la periferia [6]. En este estudio, encontramos que la inyección de suero bloqueó el reclutamiento de neutrófilos hiperreactivos en el cerebro y redujo las trampas extravasculares de neutrófilos (NET), mejorando así el deterioro de la memoria en ratones con EA. Mecánicamente, nuestro estudio aclaró los mecanismos de tráfico que subyacen a la infiltración de neutrófilos relacionados con el factor sérico VEGF-A, que medió la actividad endotelial de Cdk5 en la disminución de la secreción de CXCL1 en el cerebro con EA. Además, revelamos que la inhibición de la infiltración de neutrófilos en el cerebro con EA mediante la sobreexpresión sérica y endotelial de Cdk5 mejoró los déficits de memoria, al menos parcialmente al reducir la poda de sinapsis por parte de la microglía y elevar la actividad sináptica en el hipocampo.

Investigaciones anteriores demostraron que el bloqueo de la señalización Ly6G, un marcador específico de neutrófilos, disminuía la migración de neutrófilos a sitios inflamatorios vasculares y neurales [57]. Como resultado, demostramos que la inyección de suero redujo drásticamente la adherencia de los neutrófilos, particularmente cerca de los vasos cerebrales y la placa Aβ, y mejoró el deterioro de la memoria en ratones con EA. Además, después de la inyección de suero, se restauraron los segmentos capilares cerebrales y se bloqueó la infiltración de neutrófilos, lo que aumentó el flujo sanguíneo y la perfusión cerebral [10], lo que mejoró las capacidades cognitivas. El análisis de PPI basado en los DEP también mostró quimiotaxis mediada por citocinas séricas VEGF-A y CXCL1. Consistentemente, el VEGF-A recombinante tuvo efectos similares al anticuerpo Ly6G al bloquear la infiltración de neutrófilos en el cerebro con EA. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el VEGF-A en suero derivado de tipo salvaje mejoraba el deterioro de la memoria en ratones con EA, muy probablemente como resultado de una menor infiltración de neutrófilos.

La señalización de VEGF se reduce notablemente en el cerebro con el envejecimiento, mientras que el aumento de la señalización de VEGF protege contra la pérdida capilar relacionada con la edad, la perfusión comprometida y la oxigenación tisular reducida [22], que también se observan en pacientes con EA [58,59,60]. Además, el VEGF en el LCR se asocia con el rendimiento de la memoria longitudinal, particularmente en individuos con amiloide y Tau positivos [61], y las variantes relacionadas con el VEGF podrían parecer influir en el riesgo de EA [62]. Por lo tanto, estos informes sugirieron que la señalización de VEGF está involucrada en el desarrollo de la EA. Estudios anteriores indicaron que la inhibición de la actividad de Cdk5 en células pituitarias de rata reducía la expresión de VEGF-A [63, 64], lo que implica que existe un vínculo subyacente entre VEGF-A y Cdk5 en el endotelio. Curiosamente, en el presente estudio, el VEGF-A recombinante previno directamente la inhibición de Cdk5 mediada por Aβ y promovió la proliferación de células endoteliales en células bEnd.3, y evitó la pérdida de capilares cerebrales en un modelo de ratón con EA.

CDK5, un miembro de la familia de las quinasas dependientes de ciclina, regula la proliferación, migración y angiogénesis de las células endoteliales y participa en las principales características patológicas de la EA [65,66,67,68]. En nuestro estudio, la sobreexpresión endotelial de Cdk5 inhibió la secreción de CXCL1 y la infiltración periférica de neutrófilos en el cerebro con EA. De hecho, un estudio anterior informó que la desactivación de Cdk5 específica del endotelio provocó convulsiones espontáneas en ratones al regular positivamente la astrogliosis inducida por CXCL1 [48]. Junto con los hallazgos de una menor expresión del ARNm de Cdk5 en el hipocampo [69] y una mayor expresión del gen CXCL1 en los microvasos corticales prefrontales de pacientes con EA relacionados con Tau [70], estos resultados indican que la deficiencia de Cdk5 en las células endoteliales del cerebro promueve la secreción de CXCL1 [71] . Por lo tanto, nuestro estudio demuestra que el VEGF-A derivado del suero suprime la secreción de CXCL1 al modular la actividad de Cdk5 y, por lo tanto, previene la migración de neutrófilos al cerebro.

La interacción de los neutrófilos y la microglía se ha informado en un modelo inflamatorio inducido por LPS utilizando microscopía intravital de dos fotones [72]. Además, la IL-1β derivada de microglía y la quimiocina CXCL1 reclutan neutrófilos en un SNC infectado por hongos, de una manera dependiente del adaptador Syk CARD9 [45]. Aquí, demostramos que la activación microglial y la pérdida sináptica se previnieron mediante la sobreexpresión sérica, endotelial de Cdk5 o el bloqueo de la infiltración de neutrófilos. Por lo tanto, los neutrófilos pueden proporcionar señales proinflamatorias para promover la poda microglial en un modelo de ratón con EA. Curiosamente, demostramos que los neutrófilos infiltrados liberaban NET en varias áreas del cerebro en un modelo de ratón con EA, lo que se evitó mediante anticuerpos anti-Ly6G y tratamiento con suero. Esta interacción puede representar un mecanismo intrigante para la activación microglial mediada por NET y la poda de sinapsis neuronales [73]. Se necesitan estudios futuros para explorar las funciones de los NET productores de neutrófilos en la activación microglial y la poda sináptica en un modelo de ratón con EA.

Es importante destacar que previamente habíamos demostrado que el reclutamiento de monocitos en el cerebro mediante la activación inmune podría ejercer efectos beneficiosos contra la EA [27, 74, 75]. En el estudio actual, aunque los monocitos periféricos aumentaron después del tratamiento con suero, encontramos que la infiltración de neutrófilos, en lugar de los monocitos/macrófagos, disminuyó significativamente en el cerebro de los ratones APP/PS1. Esta es la razón por la que nos centramos específicamente en las funciones cruciales de la infiltración de neutrófilos en las patologías de la EA. El rejuvenecimiento de la sangre también podría modular la expresión de varios genes implicados en las vías de señalización neuronal hacia niveles normales. Por ejemplo, existen factores sistémicos en el plasma joven que son necesarios para obtener beneficios terapéuticos, incluida la activación de la señalización de Notch dependiendo de la regeneración [76], la restauración de la vía del factor de diferenciación de crecimiento 11 [12, 77], la regulación positiva de los niveles de oxitocina [78] y Activación de la proteína de unión al elemento de respuesta al AMP cíclico.

VEGF-A es una citoquina neuroprotectora que promueve la neurogénesis y la angiogénesis en el cerebro [79, 80]. Consistentemente, proporcionamos evidencia de que el suero rescató el nivel circulante insuficiente de VEGF-A en ratones con EA. El VEGF-A recombinante promovió la proliferación de células endoteliales in vitro y evitó la pérdida capilar in vivo. Por lo tanto, VEGF-A puede ser importante para mejorar la perfusión cerebral y el flujo sanguíneo para obtener suficiente oxígeno en la sangre, especialmente en la edad [22, 79] y en la enfermedad de Alzheimer [81]. Por lo tanto, la señalización endotelial de VEGF-A/Cdk5 puede ser una estrategia terapéutica potencial para mejorar la patología de la EA mediante la regulación de la infiltración de neutrófilos.

Además del VEGF-A, otros factores sanguíneos enriquecidos, como VCAM1, HGF y clusterina, que participan en la función de las células endoteliales vasculares, también pueden mejorar las funciones cerebrales. De hecho, una deficiencia del gen endotelial VCAM1 contrarresta los efectos perjudiciales del plasma envejecido en los cerebros jóvenes, incluida la reactividad microglial y la función de la memoria [16]. Recientemente se ha demostrado que el HGF tiene efectos beneficiosos sobre la neurogénesis del hipocampo y la función cognitiva en ratones SAMP8, otro modelo murino de EA [82]. La clusterina, un inhibidor de la cascada del complemento, puede unirse a las células endoteliales del cerebro y reducir la neuroinflamación en ratones mThy-1-hAPP751 [83]. Aún se desconoce si otros factores séricos funcionan junto con VEGF-A, pero nuestro trabajo amplía la aplicación de factores transmitidos por la sangre para restaurar las funciones cerebrales de la EA. Una terapia más dirigida o combinada que utilice factores séricos justifica más estudios.

VEGF tiene amplias funciones en múltiples vías de señalización en una variedad de tipos de células. Por ejemplo, el bloqueo del efecto del VEGF sobre los astrocitos revirtió la descomposición de la BHE [84], mientras que la inhibición de la señalización luminal del VEGF aumentó la integridad de la BHE y el flujo sanguíneo cerebral y redujo la densidad capilar en ratones APP/PS1 [85]. En este estudio, observamos que una inyección de dosis baja de VEGF-A restauró la densidad capilar cerebral en la misma cepa del modelo de ratón con EA, lo que concuerda con los datos que muestran que el tratamiento anti-VEGF redujo la densidad capilar en el trabajo de Ali. Sin embargo, no se observaron cambios significativos en la integridad y permeabilidad de la BBB en nuestro modelo de ratón AD después de la inyección de VEGF-A. La posible razón es que el modelo de ratón APP/PS1 (8 meses) que utilizamos es más joven que los animales (10 a 14 meses) utilizados en el estudio de Ali. Una explicación alternativa es que puede producirse un aumento transitorio en la permeabilidad de la BHE después del tratamiento con dosis bajas de VEGF-A, que puede restablecerse en varias horas [86]. Por lo tanto, es comprensible que la permeabilidad e integridad de la BBB no empeoraran aún más en ratones APP/PS1 tratados con VEGF-A.

Además, se ha identificado que muchas proteínas circulantes participan en la regulación de la permeabilidad de la BHE, como la endotelina-1 (EDN1) y el fibrinógeno (FG), que, según se informó, estaban aumentadas en la corteza frontal de los pacientes con EA [87]. Por lo tanto, se debe dilucidar el papel particular del VEGF-A en la permeabilidad de la BHE, la densidad capilar y el flujo sanguíneo según los tipos de células, los modelos de enfermedad y las etapas de la enfermedad. Además, la cuestión de si el suero de 8 meses podría tener los mismos efectos positivos sobre la EA que el suero de 4 a 6 meses aún seguía sin resolverse. Es una limitación del presente estudio que debe abordarse en el futuro.

Se ha propuesto que los factores transmitidos por la sangre a partir de suero/plasma joven o en ejercicio benefician las funciones cerebrales, incluida la neurogénesis, la plasticidad sináptica y la inflamación, así como el aprendizaje y la memoria, tanto en animales de edad avanzada como en modelos de ratones con EA. Por tanto, merece consideración la aplicación de factores sanguíneos en otras enfermedades neurodegenerativas. Nuestros datos proporcionan evidencia de que la señalización endotelial de VEGF-A/Cdk5 media en las moléculas de tráfico de neutrófilos, lo que destaca que el VEGF-A/Cdk5 endotelial del cerebro puede servir como un objetivo terapéutico potencial para la enfermedad de Alzheimer (Fig. 8).

El papel propuesto de la señalización endotelial de VEGF-A/Cdk5/CXCL1 en el proceso de infiltración de neutrófilos en el cerebro en ratones con EA. El VEGF-A derivado del suero de tipo salvaje suprime la expresión de CXCL1 endotelial vascular cerebral mediante la regulación positiva de la actividad de Cdk5, deteniendo así el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro en ratones con EA y mejorando el deterioro de la memoria. Receptor VEGF-AR VEGF-A, receptor 2 de quimiocina con motivo CXCR2 CXC.

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Descargar referencias

Agradecemos a la Sra. Lin Zhang, al Dr. Hongyang Zhang y a Bs. Zhenyan Yu por su amable apoyo. También agradecemos a la Sra. Qunfang Yuan y al Dr. Juntao Zou por las sugerencias para experimentos relacionados con la inmunidad innata. Agradecemos a la Plataforma Core Lab de Ciencias Médicas de la Facultad de Medicina de Zhongshan de la Universidad Sun Yat-sen.

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (82271473, 81971021, 81901339, 82172547 y 82172636), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (19ykpy99), la especialidad Science Innovation 2030-Brain Science and Brain-Inspired Intelligence Technology. Proyecto (2021ZD0201100 y 2021ZD0201102), el proyecto de planificación de ciencia y tecnología de Guangzhou (202002030441) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (2019A1515011184, 2020A151501001).

colmillo qi

Dirección actual: Departamento de Neurología, Mayo Clinic, Rochester, MN, 55905, EE. UU.

Estos autores contribuyeron igualmente: Fangfang Qi, Zejie Zuo, Kaishun Hu, Shengwen Wang, Long-Jun Wu, Kaihua Guo.

Departamento de Anatomía y Fisiología, Laboratorio clave de función y enfermedad cerebral de la provincia de Guangdong, Centro de tecnología médica avanzada, Primer hospital afiliado, Facultad de medicina de Zhongshan, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510080, China

Fangfang Qi, Rui Wang, Tong Wu, Hao Liu, Jiaoling Tang, Qingbo Wang, Yunjie Yang, Jie Xu, Zhibin Yao y Kaihua Guo

Departamento editorial de la Revista de la Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510080, China

colmillo qi

Departamento de Medicina de Rehabilitación, Tercer Hospital Afiliado, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510630, China

Zejie Zuo

Laboratorio clave provincial de Guangdong de epigenética de tumores malignos y regulación genética, Laboratorio conjunto de medicina de ARN de Guangdong-Hong Kong, Hospital Memorial Sun Yat-sen, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510120, China

Kaishun Hu

Programas de cinco años de medicina clínica en el grado 2017, Facultad de Medicina, Universidad Sun Yat-sen, Shenzhen, 528406, China

Yufeng Xie

Departamento de Neurología, Hospital Conmemorativo Sun Yat-sen, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510120, China

Liren Tan

Centro de Biología de Células Madre e Ingeniería de Tejidos, Laboratorio Clave de Ingeniería de Células Madre e Ingeniería de Tejidos, Ministerio de Educación, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510080, China

Xiaoran Zhang

Departamento de Neurología, Mayo Clinic, Rochester, MN, 55905, EE. UU.

Jiaying Zheng y Long Jun Wu

Departamento de Neurocirugía, Hospital Conmemorativo Sun Yat-sen, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510120, China

Shengwen Wang

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KG, KH, L-JW y FQ contribuyeron al diseño de este estudio y al análisis de los datos. SW, L-JW y FQ escribieron el manuscrito. FQ, SW, ZZ, RW, YX, HL, JT y TW realizaron la mayoría de los experimentos, incluida la evaluación del comportamiento, el microscopio de barrido láser confocal y los experimentos de bioquímica. XZ y QW administraron suero. LT realizó los experimentos in vitro. Todos los autores restantes participaron en la generación de los datos originales y proporcionaron una evaluación crítica del manuscrito. Todos los autores aprovaron el manuscrito final.

Correspondencia a Shengwen Wang, Long-Jun Wu o Kaihua Guo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Qi, F., Zuo, Z., Hu, K. et al. VEGF-A en suero protege contra el deterioro de la memoria en ratones transgénicos APP/PS1 al bloquear la infiltración de neutrófilos. Psiquiatría Mol (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-02097-w

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Recibido: 28 de julio de 2022

Revisado: 17 de abril de 2023

Aceptado: 27 de abril de 2023

Publicado: 06 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-02097-w

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