Aprendizaje profundo

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12575 (2023) Citar este artículo

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Las pinzas ópticas ejercen una fuerte fuerza de captura sobre las células, lo que hace que sea crucial analizar el movimiento de las células atrapadas. La rotación de las células juega un papel importante en sus patrones de natación, como en los espermatozoides. Propusimos un método rápido basado en aprendizaje profundo que puede determinar automáticamente la orientación de proyección de células de tipo elipsoidal sin un diseño óptico adicional. Este método se utilizó para analizar la rotación plana de los espermatozoides atrapados utilizando una pinza óptica, demostrando su viabilidad para extraer la rotación de la cabeza de la célula. Además, empleamos este método para investigar la actividad de los espermatozoides examinando las variaciones en las tasas de rotación de los espermatozoides en diferentes condiciones, incluida la temperatura y la potencia de salida del láser. Nuestros hallazgos proporcionan evidencia de la efectividad de este método y el método de análisis de rotación desarrollado puede tener potencial clínico para la evaluación de la calidad del esperma.

Las pinzas ópticas (OT) han sido ampliamente investigadas para atrapar y manipular micropartículas y microorganismos como perlas de poliestireno, células de levadura, espermatozoides y Escherichia coli1,2,3,4. Durante el proceso reproductivo, los espermatozoides necesitan llegar al óvulo a través del tracto reproductivo femenino. En este proceso, los espermatozoides con baja motilidad serán excluidos por barreras como el moco cervical5. Se han realizado extensas investigaciones sobre la dinámica de los espermatozoides atrapados en pinzas ópticas, abarcando estudios que investigan diversos aspectos como la quiralidad y la fuerza de motilidad6,7. Esta dirección de investigación tiene un valor potencial en el examen de la calidad del esperma único, que es crucial para las tecnologías de reproducción asistida como la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)8. Actualmente, el método principal para seguir rápidamente el movimiento de la cabeza de un espermatozoide implica el seguimiento de su centroide, que utiliza algoritmos de agrupamiento tradicionales para segmentar9,10. Luego Nascimento et al. Emplearon este método para calcular la velocidad curvilínea (VCL) de la cabeza para caracterizar la actividad de los espermatozoides11. Sin embargo, en el campo de visión de la lente objetiva de alta apertura numérica, los métodos de segmentación tradicionales tienen resultados de segmentación deficientes debido al complejo ruido de fondo. Además, para patrones de movimiento más complejos de los espermatozoides, como la rotación, se debe diseñar una configuración óptica adicional, y los algoritmos correspondientes para determinar el movimiento tridimensional de los espermatozoides suelen funcionar con relativa lentitud12.

El aprendizaje profundo se ha aplicado ampliamente en el campo de la segmentación de imágenes de células médicas, especialmente para el recuento de células particulares13, la segmentación de hígado y tumores hepáticos14, la segmentación de cerebros y tumores cerebrales15, etc. Y en comparación con los métodos tradicionales, tiene un rendimiento de segmentación y una solidez superiores16. 17.Esta herramienta también se puede combinar con pinzas ópticas y aplicarse a la localización axial de microesferas18, la predicción de la fuerza óptica de las pinzas ópticas19 y la medición de la rigidez de la trampa20. En este estudio, proponemos un método altamente eficiente que extrae la orientación de la cabeza del espermatozoide mediante segmentación basada en aprendizaje profundo. Lo combinamos con pinzas ópticas para atrapar espermatozoides dinámicamente y analizar la motilidad rotacional de los espermatozoides individuales directa y simultáneamente. Este método también es adecuado con otras células o bacterias de tipo elipsoidal como Escherichia coli. Nuestros experimentos analizaron la diferencia en la velocidad angular de rotación de los espermatozoides con diferentes potencias de salida del láser y verificaron que nuestro método tiene aplicaciones potenciales en la investigación clínica para la cuantificación de la motilidad de los espermatozoides y la detección de la motilidad de un solo espermatozoide.

Para obtener la información de la fase de proyección de los espermatozoides, utilizamos un sistema de pinzas ópticas de diseño propio como se muestra en la Fig. 1a. En nuestra configuración experimental, empleamos un láser de onda continua (Coherent Verdi G, 2W) para generar un rayo láser de 532 nm. Este rayo láser se dirigió a un sistema de conformación de haz (BSS) para su expansión. El rayo láser polarizado lineal resultante se dirigió luego a un espejo dicroico, que lo reflejaba en la abertura posterior de un objetivo de microscopio de inmersión en aceite (Nikon, inmersión en aceite 100\(\times\); NA = 1,4; WD = 0,13 mm). El haz se modula a través de un modulador de luz espacial de cristal líquido de fase pura y reflectante (Holoeye, HED6010-L-VIS) en el sistema de conformación. La solución de muestra de interés se cargó en un conjunto de muestras y se colocó en el plano focal posterior del espejo de aceite, que se controló mediante una etapa controlada por voltaje (Thorlabs; ZFM2030). La iluminación de la cámara de muestra fue proporcionada por una fuente de luz LED y la imagen de la muestra se realizó utilizando una cámara CMOS (Sentech; STC-mbs241U3V; 163 fps).

En el aparato experimental (a) y en el diagrama esquemático de extracción del ángulo de fase (b), la barra de escala blanca representa 10 \(\upmu\)m.

Antes del experimento, calibramos la posición de la trampa óptica y utilizamos una región de 150 \(\times\) 150 píxeles alrededor del centro de la trampa como región de interés (ROI) para excluir la interferencia de otros espermatozoides nadando, como se muestra en la figura. 1b. Para el área de la imagen extraída, utilizamos la segmentación de la imagen para realizar la detección del contorno y obtener la fase de proyección de la forma de la cabeza. Luego, la velocidad angular de rotación se calculó a partir de la diferencia de fase entre fotogramas consecutivos.

Para lograr resultados de segmentación más rápidos y precisos, introdujimos un algoritmo de segmentación de aprendizaje profundo. Esto se debe a que la segmentación tradicional del umbral de grises, como el conjunto de niveles y el método de agrupamiento, se ve muy afectada por el ruido en la segmentación de imágenes de células de alto aumento bajo imágenes con lentes de alta NA, como se muestra en la Fig. 2b. Además, estos métodos se basan en el ajuste manual o adaptativo de parámetros, que pueden no ser efectivos en escenas complejas. Los algoritmos de segmentación de imágenes basados en aprendizaje profundo se han convertido en un tema candente en los últimos años. En este estudio, utilizamos la red U-Net++ para la segmentación de imágenes. U-Net++ es una red de aprendizaje supervisado basada en la red neuronal totalmente convolucional, U-Net. Al rediseñar las conexiones de salto, agrega características de información de diferentes escalas semánticas en la subred del decodificador, formando una solución de fusión de características altamente flexible, y ha funcionado bien en muchos conjuntos de datos biológicos y arquitecturas troncales21. Como tipo de aprendizaje supervisado, el entrenamiento de este modelo requiere una cierta cantidad de datos para generar mejores resultados de segmentación. La Figura 2a muestra el diagrama esquemático de nuestra solución. La función de pérdida que utilizamos es la pérdida híbrida que combina la pérdida de entropía cruzada y la pérdida de coeficiente de dados suave. La pérdida híbrida se define como22

donde \({{y}_{n,c}}\in \text {Y}\) y \({{p}_{n,c}}\in \text {P}\) denota las etiquetas de destino y probabilidades predichas para la clase c (aquí solo dos clases) y el enésimo píxel en el lote de entrenamiento. Nuestro conjunto de datos de entrenamiento constaba de 125 imágenes de espermatozoides atrapados con un tamaño de 120 \(\times\) 120 píxeles y los correspondientes resultados segmentados manualmente. La profundidad de la red se estableció en 4 capas y los parámetros óptimos de la red se calcularon mediante validación cruzada. Después de procesar las imágenes de esperma segmentadas, se puede utilizar un método de umbral de binarización para extraer la máscara. A pesar del pequeño tamaño del conjunto de datos de entrenamiento, los resultados de la segmentación son notables, particularmente en comparación con los otros dos modelos, como se muestra en la Fig. 2b, donde los coeficientes de intersección sobre unión (IoU) y Dice pueden alcanzar alrededor del 90%. Los coeficientes IoU y Dice se definen de la siguiente manera23, donde S representa la máscara segmentada y T representa la máscara de verdad. Para cada uno de ellos, un valor más alto indica un mayor grado de superposición y similitud entre el resultado de la segmentación y la máscara de referencia.

Los modelos de conjunto de niveles y agrupación en clústeres del estudio utilizaron módulos proporcionados por ImageJ 1.53v24. Este enfoque puede lograr una segmentación de imágenes rápida y precisa en milisegundos mediante la implementación en GPU de alto rendimiento, logrando una segmentación en tiempo real, como se muestra en la Tabla 1. Los experimentos se realizan utilizando la GPU NIVIDA GeForce RTX 2080 con 8 GB de memoria.

Diagrama del proceso de formación del modelo (a); que muestra el conjunto de entrenamiento utilizado para el entrenamiento, incluida la imagen original y la imagen presegmentada, y el proceso de segmentación de imágenes a continuación. Comparación cualitativa entre U-net++, conjunto de niveles y método de agrupación (b); mostrando el resultado segmentado y la salida final de la máscara para los espermatozoides atrapados. Las puntuaciones cuantitativas correspondientes se proporcionan en la parte inferior de cada predicción (IoU|Dice). Fotogramas de un espermatozoide atrapado a 0 ms, 100 ms, 200 ms y 300 ms (c), con las imágenes originales mostradas en la parte superior, las imágenes segmentadas en el medio y los resultados extraídos del contorno en la parte inferior. La etiqueta verde representa la fase de la elipse ajustada.

La orientación proyectada de los espermatozoides debe determinarse a partir de la imagen segmentada. La cabeza del espermatozoide humano es plana y elíptica, con una longitud de aproximadamente 4 a 5 \(\upmu\)m y una anchura de aproximadamente 2,5 a 3,5 \(\upmu\)m25. Esta forma elíptica es diferente de la forma circular de las células típicas, por lo que la orientación bidimensional de los espermatozoides se puede determinar visualmente. En este estudio, se utiliza la herramienta de ajuste elíptico proporcionada por OpenCV26 para aproximar la forma de la cabeza del espermatozoide en la imagen en escala de grises obtenida de la imagen del esperma segmentado, y se obtiene la información de fase \(\alpha\) de la cabeza, como se muestra en la figura 1b. La Figura 2c muestra una serie de imágenes de espermatozoides segmentados en cuatro momentos diferentes, junto con los resultados del ajuste de elipse. Se puede observar que la fase se extrae con precisión. A pesar de que el resultado segmentado aparece ovalado cuando los espermatozoides están en posición lateral, la fase aún se adquiere con precisión. Luego, la velocidad angular absoluta se obtiene utilizando el método de diferencia directa, como se muestra en la siguiente ecuación, donde k significa el k-ésimo cuadro, fps denota la velocidad de grabación de 163 cuadros por segundo:

La metodología antes mencionada se empleó para determinar el valor de fase de un espermatozoide en rotación bajo control de captura óptica utilizando muestras de esperma obtenidas de un solo macho sano. El experimento se realizó a una temperatura de 23 \(^{\circ }\)C. La potencia de salida del láser se fijó en 400 mW. La potencia de captura del láser que llega a los espermatozoides se puede medir con un medidor de potencia y es de aproximadamente 120 mW, lo que da como resultado un aumento de temperatura de alrededor de 1 \(^{\circ }\)C27,28,29. Para tratar de minimizar el potencial de daño a los espermatozoides inducido por la luz, la duración de la captura de los espermatozoides atrapados se limitó a no más de 4 s30. Para facilitar el análisis comparativo, optamos por seleccionar tres espermatozoides representativos para la evaluación, a saber, \(S_0\), \(S_1\) y \(S_2\). \(S_0\) parecía estar inactivo bajo observación microscópica con un movimiento mínimo o nulo detectable, mientras que tanto \(S_1\) como \(S_2\) exhibían rápidos movimientos oscilatorios de la cabeza en un estado atrapado que contrastaba con el estado muerto de \ (S_0\). Las Figuras 3a – c, d – f ilustran la información de fase y la velocidad angular calculada para los tres espermatozoides mencionados anteriormente. Se puede ver que para el espermatozoide básicamente inactivo, la señal en la Fig. 3d muestra escasez de baja frecuencia, mientras que la señal en la Fig. 3e, f es densidad de alta frecuencia. Para la señal de velocidad angular, utilizamos un diagrama de caja para el análisis estadístico. Los resultados se muestran en la Fig. 3g. Se puede ver que para \(S_0\), tanto la media como la mediana tienden a ser 0, mientras que para los otros dos espermatozoides más activos atrapados, su media y mediana son relativamente mayores. Además, utilizamos una prueba t de dos muestras en estadística para determinar si existe una diferencia significativa en la velocidad angular media entre los dos grupos. Y los resultados sugieren que los niveles de actividad de rotación de los espermatozoides \(S_2\) eran probablemente más altos que los de los espermatozoides \(S_1\), como lo indica un valor p estadísticamente significativo de menos de 0,01. En consecuencia, podríamos seleccionar los espermatozoides \(S_2\) como objetivo de nuestra investigación debido a sus niveles de motilidad relativamente más altos en comparación con los espermatozoides \(S_1\).

Señal de ángulo de fase y velocidad angular correspondiente para diferentes motilidades de los espermatozoides \(S_0\) (a,c), \(S_1\) (b,e) y \(S_2\) (c,f) cuando están atrapados en el Antiguo Testamento. Comparación de la velocidad angular de los espermatozoides antes (datos verdes) y después (datos azules) de ser atrapados. Se representan los valores medios con 25-75% de los datos. El nivel de significancia se fijó en **p < 0,01.

Además, rastreamos manualmente la trayectoria de los espermatozoides no atrapados (aproximadamente 40 cuadros) con la ayuda de ImageJ24 y utilizamos el método de seguimiento del ROI para proporcionar la velocidad angular de los espermatozoides nadadores antes de la captura, como se muestra en la Fig. 3f. Se puede observar que la distribución de velocidades de la señal de los espermatozoides no atrapados es mayor. Esto se debe a que los espermatozoides experimentarán el torque de la trampa óptica durante la rotación, lo que hará que la velocidad de rotación disminuya, como se muestra en el rango más amplio del 25 al 75% del grupo de natación en comparación con el grupo atrapado. Sin embargo, la potencia de producción promedio de los espermatozoides atrapados y no atrapados es básicamente la misma.

Para confirmar aún más la viabilidad del método. Dividimos el esperma de la misma muestra en dos partes (aproximadamente 800 \(\upmu\)L cada una), una se refrigeró a 4 \(^{\circ }\)C durante 6 h y la otra se almacenó a temperatura ambiente. temperatura (23 \(^{\circ }\)C) durante 6 h para el análisis estadístico de la velocidad angular promedio con una potencia de salida del láser de 400 mW. Para evitar en la medida de lo posible el aumento de la motilidad de los espermatozoides refrigerados causado por el recalentamiento, reemplazamos la muestra y capturamos los espermatozoides después de 5 capturas. Los resultados se muestran en la Fig. 4a. Se puede observar que la actividad promedio del esperma refrigerado se reduce en aproximadamente un 30%, lo que es consistente con la disminución esperada en la actividad del esperma después de la refrigeración. Mientras tanto, elegimos 300 mW, 400 mW y 500 mW como potencia de salida del láser manteniendo otras condiciones constantes para adquirir la velocidad angular de los espermatozoides atrapados bajo diferentes potenciales de energía de captura. Con respecto al aumento de temperatura causado por la captura óptica, debido a una diferencia de 30 mW entre las potencias reales de captura del láser, la diferencia de temperatura máxima inducida por diferentes potencias de láser permanece dentro de 1 \(^{\circ }\)C27,28,29. Esta diferencia de temperatura tiene un impacto mínimo en el experimento. Como se muestra en la Fig. 4b, se puede ver que a estos niveles de potencia, los espermatozoides pueden quedar atrapados de manera estable. Es evidente que a 400 mW, los espermatozoides atrapados tienen la velocidad angular promedio más alta y el rango de distribución más amplio. Mientras que a 500 mW y 300 mW, sus velocidades son relativamente bajas y sus rangos estrechos. Probablemente esto se deba a dos razones: el torque ejercido sobre el objetivo capturado presenta una correlación positiva con el aumento de intensidad, que está directamente relacionado con la potencia de salida del láser31,32. A 500 mW, el par de resistencia es demasiado alto, lo que provoca una amortiguación excesiva del esperma y limita su rotación; mientras que a 300 mW, la energía es demasiado baja para capturar espermatozoides altamente activos33, lo que resulta en una menor motilidad de rotación de los espermatozoides capturados. Por lo tanto, 400 mW es la potencia de salida ideal con el mayor rango de motilidad de rotación de los espermatozoides capturados, y la potencia seleccionada en aplicaciones prácticas debe estar por encima de la potencia de salida adecuada para lograr la máxima distinguibilidad.

Comparación de la velocidad angular de los espermatozoides a diferentes temperaturas (a), con espermatozoides no refrigerados a la izquierda y espermatozoides refrigerados a la derecha. Se representan los valores medios ± DE con datos del 25 al 75 % (datos verdes y puntos azules). Comparación de la velocidad angular del esperma para diferentes potencias de salida del láser (b). Se representan los valores medios ± DE con datos del 25 al 75 %. En ambos, n representa el número total de muestras.

Este artículo de investigación propone un método basado en aprendizaje profundo para la segmentación de imágenes de cabezas de espermatozoides, que permite la extracción dinámica de la velocidad angular de rotación como criterio para la detección de la motilidad de los espermatozoides atrapados ópticamente. El estudio demuestra la confiabilidad del método al comparar muestras de esperma normales y refrigeradas e identifica el rango óptimo de potencia del láser para maximizar la distinción entre espermatozoides. Esta investigación proporciona una base sólida para la selección posterior de esperma utilizando pinzas ópticas y tiene potencial para aplicaciones clínicas como ICSI, que podría mejorar los resultados para las parejas que enfrentan desafíos de fertilidad (Información complementaria).

Las muestras de semen humano se recolectaron de pacientes individuales en el Centro de Medicina Reproductiva, el primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Anhui. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado antes de ser incluidos en el estudio. Las muestras de semen se diluyeron en medio de fertilización (Cook Medical, EE. UU.) y se almacenaron a 4 \(^{\circ }\)C para experimentos posteriores. Antes de cargarlas en el conjunto de muestras del instrumento de pinzas ópticas de construcción propia, las muestras de esperma se diluyeron aún más en 20 a 40 veces con medio de fertilización.

Todos los análisis se realizaron utilizando Origin 2021b. Se consideró significativo un valor de P bilateral de \(<0,05\).

Los estudios con participantes humanos fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética Biomédica de la Universidad Médica de Anhui. Los pacientes/participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones universitarias para la experimentación con esperma.

Los conjuntos de datos utilizados y analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Los autores agradecen a la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 12232017, 11627803, 32061160475 y 12222212) por el apoyo financiero y al primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Anhui por proporcionar las muestras.

Laboratorio clave CAS de comportamiento mecánico y diseño de materiales, Departamento de Mecánica Moderna, Universidad de Ciencia y Tecnología de China, Hefei, 230027, China

Jiangcheng Zhao, Chuanbiao Bai y Qingchuan Zhang

Escuela de Ingeniería Biomédica, Instituto Provincial de Medicina Traslacional de Anhui, Universidad Médica de Anhui, Hefei, 230027, China

Zhang Zhiguo

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JZ concibió y llevó a cabo los experimentos bajo la dirección de QZ con la ayuda de CB y ZZ. El manuscrito fue escrito por JZ en discusión con todos los demás autores.

Correspondencia a Qingchuan Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Zhao, J., Bai, C., Zhang, Z. et al. Método basado en aprendizaje profundo para analizar la rotación de los espermatozoides atrapados ópticamente. Representante científico 13, 12575 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39819-7

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Recibido: 18 de mayo de 2023

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39819-7

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