Intervenciones optogenéticas y farmacológicas vinculan las neuronas de hipocretina con la impulsividad en ratones

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 74 (2023) Citar este artículo

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Las neuronas del hipotálamo lateral que expresan el neuropéptido hipocretina, también conocido como orexina, son moduladores críticos de la estabilidad de la excitación. Sin embargo, su papel en los diferentes componentes del constructo de excitación, como la atención y la toma de decisiones, no se comprende bien. Aquí estudiamos la dinámica del circuito neuronal de hipocretina durante la impulsividad de la acción de parada en una tarea Go/NoGo en ratones. Mostramos que la actividad neuronal de hipocretina se correlaciona con la anticipación de la recompensa. Luego evaluamos el papel causal de la actividad neuronal de hipocretina utilizando optogenética en una tarea Go/NoGo. Mostramos que la estimulación de las neuronas hipocretinas durante el período de señal aumenta drásticamente el número de respuestas prematuras. Estos efectos son imitados por la anfetamina, reducidos por la atomoxetina, un inhibidor de la captación de norepinefrina, y bloqueados por un antagonista selectivo del receptor 1 de hipocretina. Concluimos que las neuronas hipocretinas tienen un papel clave en la integración de estímulos destacados durante la vigilia para producir respuestas apropiadas y oportunas a señales gratificantes y aversivas.

Las Hipocretinas (Hcrts), también conocidas como orexinas, son dos neuropéptidos derivados de un mismo precursor1,2. Las neuronas que producen péptidos Hcrt están restringidas al área hipotalámica lateral, pero sus proyecciones se extienden ampliamente por todo el cerebro3. Estudios anteriores han demostrado que la integridad del sistema Hcrt es esencial para la estabilidad de la excitación; La pérdida de neuronas Hcrt en perros, ratones y humanos produce narcolepsia con cataplejía. Se cree que esta estabilidad se ejerce mediante la integración de múltiples variables de las conexiones hipotalámicas locales, así como de aferencias del hipocampo, el tabique y la amígdala4.

Además del papel demostrado en las transiciones del estado de excitación, múltiples líneas de evidencia han colocado al sistema hipocretina/orexina como un relevo importante en el procesamiento de la recompensa cerebral5,6. Nosotros y otros demostramos que el antagonismo de Hcrt R reduce la motivación para buscar una recompensa7 y bloquea el restablecimiento del estrés de la búsqueda de cocaína8,9. Es probable que este efecto se deba a un aumento duradero en la excitabilidad dopaminérgica provocada por la liberación de Hcrt10,11,12 a través de la señalización de HcrtR113,14.

La impulsividad, a menudo definida como una acción sin previsión ni consideración de las consecuencias, es una característica esencial de numerosas afecciones psiquiátricas, incluidas la adicción y el trastorno bipolar15,16. Una característica común importante de la excitación y la adicción reside en la integración de señales destacadas para tomar decisiones apropiadas orientadas a objetivos. Anteriormente demostramos que la actividad de las neuronas Hcrt se correlaciona con la exposición a estímulos de valencia tanto positiva como negativa17,18. Sin embargo, se desconoce si la actividad Hcrt provocada por esos estímulos tiene algún efecto en la toma de decisiones. Aquí hemos estudiado el papel de la actividad de Hcrt en la toma de decisiones y la impulsividad de acción mediante la modulación del sistema Hcrt utilizando farmacología y optogenética durante una tarea Go/NoGo establecida.

Utilizamos fotometría de fibra para monitorear la actividad de las neuronas Hcrt en una tarea Go/NoGo. Entrenamos ratones knockin Hcrt-IRES-cre18 en la tarea Go/NoGo con una precisión de hasta el 70%, les infundimos un vector viral que codifica GCamp6f e implantamos una fibra óptica en el hipotálamo lateral (Figura complementaria 3). Registramos la actividad neuronal de Hcrt a lo largo de la tarea Go/NoGo y analizamos el cambio de señal fuera de línea durante las transiciones entre las fases de la tarea (Precue, Go y NoGo Cues, Reward, ITI). Como se muestra en las figuras 1A y D, las respuestas de calcio tendieron a aumentar en la transición de los períodos de preseña a señal, particularmente en animales que respondieron correctamente a la señal Go (Tiempo x Interacción de transición F(1,4) = 2,69, p = 0,10 ). Los trazos correctos de Go fueron significativamente diferentes de los de Precue (Fig. 1D; p = 0,03). Esta señal contrasta con los bajos niveles de actividad observados durante el período NoGo Cue (Fig. 1B). Los animales que tuvieron respuestas incorrectas mostraron diferencias moderadas, pero significativas, en las señales de calcio tras la exposición a señales, consistentes con una respuesta a estímulos destacados18. Las señales de calcio aumentaron progresivamente durante el período Go Cue y alcanzaron niveles máximos coincidentes con la entrega de una recompensa (Fig. 1B) (Tiempo F (1,4) = 9,27, p = 0,04). Por el contrario, el perfil de actividad del calcio de las neuronas Hcrt permaneció bajo durante la señal NoGo, pero también mostró un pico inmediatamente después del nosepoke. La transición de la recompensa al final de la prueba en el período de intervalo entre pruebas también mostró un pico en la actividad (Fig. 1C, F) (Tiempo F(1,4) = 7,88, p = 0,048), pero ambos Correcto Los grupos Go y NoGo mostraron respuestas similares (Tiempo x Transición F(1,4) = 0,007, p = 0,94). No se detectó ninguna señal fluorescente en ratones de tipo salvaje (Hcrt-IRES-cre-) (Figura 1 complementaria).

Media ΔF/F de las neuronas Hcrt 5 s antes y 5 s después (A, D) Precue to Cue, (B, E) Cue to Reward o (C, F) Reward to ITI transiciones en la tarea Go/NoGo. A – C El tiempo 0 y la línea de puntos vertical indican el punto de transición. El tono del color denota la respuesta de los animales en la tarea Ir/No Ir. La región sombreada representa SEM. La fila inferior (D – F) muestra la señal media durante 1 s antes y 1 s después de la transición etiquetada arriba. *denota diferencia entre grupos (prueba de Bonferroni, p < 0,05).

Para determinar si el pico de actividad de Hcrt fue causal de la acción impulsiva, utilizamos la estimulación optogenética de las neuronas Hcrt durante los primeros 5 s de las señales Go y NoGo. Elegimos parámetros que sean consistentes con grabaciones in vivo de neuronas Hcrt19 a 5 y 10 Hz. La estimulación durante la señal Go no afectó significativamente el número de respuestas (P > 0,05) (Fig. 2A). Sin embargo, la estimulación con Hcrt durante la señal de NoGo redujo drásticamente la probabilidad de ensayos NoGo correctos (p <0,001 RM-ANOVA con comparaciones múltiples de Bonferroni) (Fig. 2B; Películas complementarias 1 y 2). Curiosamente, la estimulación optogenética de Hcrt durante el período previo a la señal también aumentó las respuestas prematuras en animales Hcrt-cre, pero no en ratones de control de tipo salvaje (P > 0,05, RM-ANOVA) (Fig. 2C). Estos resultados sugieren firmemente que las neuronas Hcrt responden a señales destacadas asociadas con una recompensa y que la actividad se suprime si se requiere una inhibición conductual.

Los efectos de la estimulación optogenética de 5 o 10 Hz de las neuronas Hcrt en el comportamiento Go/NoGo. Una estimulación Hcrt no tiene ningún efecto sobre la probabilidad de una respuesta Go correcta, pero (B) reduce la probabilidad de una respuesta NoGo correcta y (C) aumenta la tasa de respuesta previa. No se observan efectos en los controles Hcrt-cre- (gris). El color indica el genotipo y el tono indica la frecuencia del láser. *denota diferencia con respecto a los ensayos de control sin láser dentro del mismo genotipo (prueba de Bonferroni, p < 0,05) y † denota diferencia con respecto a los controles Hcrt-cre- en esa frecuencia de láser particular. Los diagramas de caja indican promedios y desviación estándar. Los bigotes abarcan valores máximos y mínimos.

Hcrt ejerce su acción sobre dos GPCRS que se unen de manera diferencial a Hcrt1 y Hcrt2. Los estudios en animales knockout indican que tanto la señalización de HcrtR1 como de HcrtR2 afectan la estabilidad del sueño/vigilia20, mientras que HcrtR1 modula los efectos sobre la función de recompensa cerebral21. Por lo tanto, utilizamos un antagonista selectivo de HcrtR1 para probar si la señalización de HcrtR1 es necesaria para el efecto de Hcrt sobre la impulsividad.

Para calibrar el efecto de los antagonistas de HcrtR1, evaluamos las respuestas de los animales en la tarea Go/NoGo después de inyecciones de diferentes dosis de anfetamina (Figs. 3A, D, G), (1 y 2,5 mg administrados 10 minutos antes del ensayo, un psicoestimulante conocido por aumentar la elección impulsiva 22 o atomoxetina (Fig. 3B, E, H), un inhibidor de la recaptación noradrenérgica que mejora el rendimiento en la tarea Go/NoGo 23. De hecho, el tratamiento con anfetamina, de forma dependiente de la dosis, redujo la probabilidad de NoGo (P <0,05 RM- ANOVA) (Fig. 3D), mientras que la atomoxetina mejoró ligeramente el rendimiento de los ratones (P <0,05 RM-ANOVA) (Fig. 3B, H). De manera similar a la atomoxetina, el antagonista selectivo de HcrtR1 aumentó de forma dependiente de la dosis la probabilidad de No Go y redujo la Tasa de respuesta previa a la señal (P <0,05 RM-ANOVA) (Fig. 3F, I).

La anfetamina disminuye la tasa de respuesta correcta de NoGo (D) y aumenta la tasa de respuesta de PreCue (G), pero no altera la tasa de respuesta correcta de Go (A). Por el contrario, la atomoxetina aumenta la tasa de respuesta correcta de Go (B) y disminuye la tasa de respuesta de PreCue (H), pero no altera la tasa de respuesta correcta de NoGo (E). El antagonismo selectivo de HcrtR1 disminuye la tasa de respuesta correcta de Go (C) y la tasa de respuesta de PreCue (I) y aumenta la tasa de respuesta correcta de NoGo (F). Los datos del vehículo se comparten entre los grupos de anfetamina y atomoxetina (administrado IP), mientras que los datos del antagonista HcrtR1 se comparan con el vehículo administrado en la misma modalidad (administración forzada oral). *denota diferencia entre el tratamiento del vehículo (prueba de Bonferroni, p < 0,05). Los diagramas de caja indican promedios y desviación estándar. Los bigotes abarcan valores máximos y mínimos.

Luego comparamos las respuestas operantes en un paradigma Go/NoGo después de la estimulación optogenética de Hcrt y el tratamiento farmacológico sistémico con anfetamina (Fig. 4A, D, G), atomoxetina (Fig. 4B, E, H) o un antagonista selectivo de HcrtR1 (Fig. .4C, F, I). La probabilidad de respuestas prematuras durante el período previo a la Cue aumentó mediante la administración sistémica de anfetamina, de manera similar a la estimulación neuronal Hcrt (Fig. 4G) (P <0,05 efectos principales del tratamiento, genotipo en RM-ANOVA bidireccional). Por el contrario, el tratamiento con atomoxetina, un inhibidor de la captación noradrenérgica conocido por aumentar la atención y disminuir la impulsividad24, recuperó parcialmente los efectos de la fotoestimulación Hcrt (Fig. 4E, H) (P <0,05 efectos principales e interacción del tratamiento y genotipo en RM bidireccional -ANOVA). El antagonista de HcrtR1 recuperó completamente el aumento de las respuestas prematuras provocadas por la estimulación de Hcrt (Fig. 4F) (P <0,05 efectos principales e interacción del tratamiento y genotipo en RM-ANOVA bidireccional).

Los efectos de la estimulación con Hcrt de 10 Hz concurrente con la administración de anfetamina (A, D, G), atomoxetina (B, E, H) o antagonista de HcrtR1 (C, F, I) en varias dosis sobre la tasa de respuesta correcta de Go (A, B, C, estimulación entregada durante los primeros 5 s del período Go Cue), tasa de respuesta correcta NoGo (D, E, F, estimulación entregada durante los primeros 5 s del período NoGo Cue) y tasa de respuesta PreCue (G, Se muestran H, I, estimulación administrada durante los últimos 5 s del período PreCue). El color indica el genotipo (púrpura para hcre-cre+ y gris para los controles) y el tono indica la dosis (más oscuro para dosis más altas). Los datos del vehículo se comparten entre los grupos de anfetamina y atomoxetina (administrado IP), mientras que los datos del antagonista HcrtR1 se comparan con el vehículo administrado en la misma modalidad (administración forzada oral). *denota diferencia con respecto al vehículo dentro del mismo genotipo (prueba de Bonferroni, p < 0,05); † denota diferencia con los controles Hcrt-cre- en esa dosis particular (prueba de Bonferroni, p < 0,05).

La impulsividad, que conduce a una mala toma de decisiones, está asociada con muchos trastornos psiquiátricos y del comportamiento, como el trastorno por déficit de atención/hiperactividad, la alimentación y el abuso de sustancias25,26,27. Múltiples estudios han establecido una relación entre el consumo de cafeína, la pérdida de sueño, las conductas de riesgo y la impulsividad28,29, aunque se desconocen los mecanismos neuronales de dichas relaciones. La Ley de Yerkes-Dodson establece que existe una relación entre la excitación fisiológica y el rendimiento hasta cierto punto, donde un exceso de excitación conduce a un mal rendimiento. De hecho, existe evidencia de que la hipoactivación en pacientes narcolépticos con deficiencia de Hcrt produce déficit de atención30. Aquí utilizamos una tarea Go/NoGo para evaluar el rendimiento y el comportamiento de impulsividad motora en ratones y probamos si la excitación impulsada por el neuropéptido Hcrt seguía la ley de Yerkes-Dodson. Mostramos que la hiperactivación inducida por la estimulación optogenética de las neuronas Hcrt en frecuencias consistentes con su perfil de actividad fásica31,32 también disminuye el rendimiento de la atención.

El aumento de la impulsividad causado por la actividad de Hcrt es consistente con otros informes que muestran una disminución de la impulsividad hacia la cocaína tras el tratamiento con suvorexant, un antagonista dual de HcrtR33. Las neuronas Hcrt parecen activarse por una gran cantidad de estímulos destacados de valencias tanto positivas como negativas17,18. Por lo tanto, la actividad de Hcrt puede interpretarse como una señal de alerta/emergencia que activa rápidamente los circuitos de excitación monoaminérgicos. Utilizando cFos, Freeman et al. 34 mostraron que la activación de las neuronas Hcrt hipotalámicas mediales, pero no de las laterales, se correlacionaba con una mayor precisión en la tarea Go/NoGo. La mala resolución temporal de la inmunorreactividad de cFos (60 minutos después de la sesión Go/NoGo) impide comparaciones directas con nuestros estudios. Una limitación de nuestros resultados es que la colocación exacta de la cánula no se pudo verificar anatómicamente debido a la mala calidad del tejido. Sin embargo, probamos la ubicación precisa antes de los experimentos optogenéticos monitoreando las transiciones de sueño/vigilia después de una estimulación de 10 Hz. Este método demostró ser extremadamente confiable en nuestro trabajo anterior17. También verificamos la precisión de las condiciones de inyección y la expresión eutópica de los transgenes en animales nuevos (Figuras complementarias 2 y 3).

¿Qué mecanismo impulsa la impulsividad provocada por las neuronas Hcrt? El circuito neuronal subyacente a Go/NoGo se ha asociado con la integridad funcional y estructural de los sistemas cerebrales que se sabe que están comprometidos en la dependencia de drogas estimulantes en humanos35,36 y roedores26,27. La capacidad de inhibir acciones después de que se ha formado un hábito se ha relacionado clásicamente con los bucles neuronales entre el área tegmental ventral (VTA) y la capa del núcleo accumbens (NAcc), así como con los bucles corticostriatales. Sin embargo, todavía no se comprende bien cómo estas estructuras son moduladas por la excitación y la atención. Las interacciones entre la capa NAcc y el VTA se han propuesto como el sustrato principal de la impulsividad de espera, mediante la cual las neuronas VTA se proyectan a las células GABAérgicas en la capa NAcc, que se proyectan de regreso a las interneuronas GABA en el VTA. La respuesta prematura impulsiva se asocia con una disminución de la liberación de dopamina en el núcleo y una mayor liberación de dopamina en la subregión de la cáscara37. Hay evidencia sustancial que muestra conexiones recíprocas entre Hcrt, neuronas que contienen el receptor D2 en la capa NAcc y el VTA. Hcrt1 aumenta la activación de las neuronas de la capa NAcc laterales y mediales38. Recientemente González et al. 39, mostraron que las neuronas Hcrt aumentaron su actividad durante el acercamiento a los alimentos, y esta actividad disminuyó al nivel inicial al inicio del comportamiento consumatorio, mediado por interacciones recíprocas entre la capa de las neuronas NAcc y Hcrt. Es poco probable que la reducción de las respuestas correctas de Go observadas después del tratamiento con un antagonista de Hcrt R1 (Fig. 2C) se deba a un aumento de la somnolencia20, ya que los ratones knockout para Hcrt R1 tienen un fenotipo de sueño leve; en cambio, estos ratones indican que HcrtR1 es necesario para la respuesta reforzada por alimentos, la motivación o ambas21. Blomeley et al. 40 describieron un circuito excitador directo Hcrt→D2 y demostraron que la actividad de las células D2 es necesaria para evitar riesgos innatos dependientes de Hcrt en ratones40. La dinorfina, que es coliberada por Hcrt+ en la LH, inhibe la mayoría de las neuronas dopaminérgicas que proyectan la capa medial de NAcc y la amígdala basolateral, pero reduce la activación solo en una pequeña fracción de aquellas que se proyectan a la capa lateral de NAcc. Se ha sugerido que la activación de los receptores opioides Kappa aumenta la impulsividad en el 5CSRRT41. Nuestra estimulación optogenética de las neuronas Hcrt puede haber aumentado la liberación de dinorfina42,43. Por lo tanto, es concebible que los cambios en la relación E/I provocados por la liberación de Hcrt en la capa de NAcc puedan provocar respuestas prematuras, ya sea mediante la unión a los receptores de Hcrt en las neuronas D2 o las interneuronas NPY+. Es de destacar que el efecto neuromodulador de Hcrt en la NAcc parece ser específico, ya que la activación quimiogenética de las neuronas VTA no afecta la impulsividad44,45. La actividad de Hcrt también puede cambiar el equilibrio E/I de las salidas hipotalámicas: la excitación de la neurona LH(GAD65) induce una actividad locomotora elevada, mientras que la inhibición de la actividad natural de la neurona LH(GAD65) deprime la locomoción voluntaria46. Por lo tanto, el circuito Hcrt → LH(GAD65) puede ayudar a crear el impulso para funcionar, lo que se refleja en el ensayo Go/NoGo como un aumento de respuestas prematuras.

Además del circuito canónico de la capa VTA → NAcc, la estimulación optogenética de Hcrt activa el locus coeruleus (LC)47, una estructura también involucrada en el comportamiento impulsivo mediado por la liberación de noradrenalina en la corteza prefrontal (PFC)48 o la NAcc49. La liberación de noradrenalina (NE) en la capa de NAcc juega un papel importante en los efectos de la atomoxetina sobre la impulsividad, mientras que la NE en la PFC atenúa los efectos de la anfetamina sobre la conducta impulsiva. Dado que la estimulación optogenética de Hcrt no cambió los efectos de la anfetamina sobre la impulsividad, la NE parece modular la acción de Hcrt en la NAcc.

Utilizando fotometría de fibra, hemos demostrado que la actividad neuronal Hcrt en el hipotálamo lateral alcanza su punto máximo en el momento de entregar una recompensa en las pruebas de Go, lo que coincide con el 74 % de neuronas que aumentan su tasa de activación en los registros globales de una tarea de elección50. Estudios recientes de Burdakov et al. 46 y nuestro propio laboratorio17 indican que las neuronas Hcrt son sensibles a múltiples estímulos destacados y el aumento de la concentración de Ca2+ durante la sesión de Go puede reflejar dicha prominencia (Fig. 1). Se observaron perfiles de fotometría similares al registrar las respuestas de las neuronas noradrenérgicas TH+ en el Locus coeruleus, una estructura cerebral involucrada de manera crítica en la atención. Trabajos anteriores de nuestro laboratorio demostraron que las neuronas Hcrt se proyectan densamente a LC y que el bloqueo optogenético de la actividad neuronal de LC previene las transiciones del sueño a la vigilia inducidas por Hcrt47. Los perfiles de fotometría de las neuronas Hcrt y LC también fueron similares cuando se registraron durante las pruebas NoGo correctas y durante las respuestas prematuras en las sesiones NoGo. La conexión HcrtLC probablemente se señalice a través de los receptores HcrtR1 según su patrón de expresión informado en LC51,52. En consecuencia, los antagonistas de HcrtR1 pudieron reducir las respuestas prematuras provocadas por la anfetamina.

El TDAH se caracteriza por un nivel de falta de atención, impulsividad y/o hiperactividad inadecuado para el desarrollo, y se han utilizado atomoxetina y otros estimulantes para tratar a adultos con este trastorno53. De hecho, aquí mostramos que la atomoxetina, un inhibidor de la captación noradrenérgica, restaura parcialmente las respuestas normales después de la impulsividad provocada por la estimulación optogenética de Hcrt. Un antagonista selectivo de Hcrt R1 pareció más eficaz para rescatar la probabilidad de conducta inhibitoria en la prueba de impulsividad, lo que sugiere una posible aplicación clínica en el tratamiento de trastornos psiquiátricos con impulsividad desadaptativa.

Aquí hemos demostrado una relación causal entre la activación de las neuronas Hcrt y la impulsividad tanto de espera como de parada. La estimulación optogenética de las neuronas Hcrt aumentó las respuestas prematuras en los ensayos NoGo, mientras que un antagonista selectivo de HcrtR1 redujo el efecto de la anfetamina en una tarea Go/NoGo. Es probable que este efecto esté mediado por mecanismos dopaminérgicos y noradrenérgicos en el cuerpo estriado y la PFC. La solidez y especificidad de los antagonistas de HcrtR1 en esta tarea los convierte en excelentes herramientas farmacológicas para tratar el TDAH y otros trastornos asociados con la impulsividad.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. y fueron aprobados por el Panel administrativo de cuidado de animales de laboratorio de la Universidad de Stanford (protocolo ID n.° 18787).

Los animales recibieron cada medicamento/dosis en un orden aleatorio para protegerlos contra los efectos del orden, con al menos 3 días entre los días de tratamiento para permitir un lavado suficiente. El clorhidrato de atomoxetina se obtuvo de Sigma (Y0001586) y se disolvió en NaCl (solución salina) al 0,9 % que se administró mediante inyección intraperitoneal en una dosis de 5 mg/kg o 10 mg/kg 30 minutos antes del inicio del Go/NoGo. prueba. El hemisulfato de D-anfetamina se obtuvo de Sigma (A5880 y se disolvió en NaCl (solución salina) al 0,9% que se administró mediante inyección intraperitoneal en una dosis de 1 mg/kg o 2,5 mg/kg 10 minutos antes del inicio del Go/ Prueba NoGo22,54). Además, se obtuvo un antagonista de HcrtR1 de Boehringer Ingelheim (patente WO2017/178339) y se disolvió en 0,5 % de hidroxietilcelulosa (Sigma, 525944) y 0,015 % de Tween 80 (Sigma, P1754) en agua que se administró mediante sonda oral a una dosis de ya sea 2,5 mg/kg, 7,5 mg/kg o 12,5 mg/kg. Además de los 7 grupos de fármaco/dosis, se incluyeron dos grupos de control en los que los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de solución salina 10 minutos antes del inicio de la prueba Go/NoGo o recibieron la solución vehículo utilizada para administrar el compuesto HcrtR1 por vía oral. sonda 60 minutos antes del inicio de la prueba Go/NoGo.

Se criaron en casa ratones macho heterocigotos knock-in Hcrt-IRES-Cre (Hcrt-cre +) retrocruzados sobre fondo C57BL6J (N9), y se utilizaron compañeros de camada de tipo salvaje (Hcrt-cre-) como controles. Los ratones se alojaron en grupos de hasta cinco ratones en cámaras de plexiglás con temperatura estable (22 ± 1 ˚C), humedad (40–60%) y condiciones de iluminación (9:00 a. m. a 9:00 p. m. oscuros; 9: 00 pm–9:00 am luz). En el momento del inicio del entrenamiento, los ratones pesaban ~27 g. Durante el entrenamiento, los ratones pasaron a un paradigma de restricción de agua, en el que se les dio acceso al agua durante 2 a 4 h al final de su período activo. Todo el entrenamiento, grabación y manipulación ocurrieron durante el período oscuro.

Los ratones se anestesiaron con una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (20 mg/kg) y se montaron en un marco estereotáxico animal (David Kopf Instruments) y recibieron inyecciones de 0,3 µl de AAV-DJ-EF1α-DIO-hChR2( H134R)-virus eYFP (2,5 × 1012 copias del genoma por ml, Stanford Virus Core) al hipotálamo lateral (LH) derecho o izquierdo (AP: − 1,35 mm, ML: ± 0,95 mm, DV: −5,15 mm) con un 5 µl de microjeringa Hamilton. Se implantó una fibra de vidrio (200 μm de diámetro, lentes dóricas, Franquet, Québec, Canadá) con la punta justo encima del sitio de inyección para estimulación optogenética. Para la fotometría de fibra, se entregaron 0,3 µl de vectores AAV que portaban genes que codifican GCaMP6f (AAV-DJ-EF1α-DIO-GCaMP6f, 1,1 × 1013 copias del genoma por ml, Stanford Virus Core) a la LH derecha o izquierda (AP: −1,35 mm, ML: ± 0,95 mm, DV: −5,15 mm) con una microjeringa Hamilton de 5 μl y se implantó una fibra de vidrio (400 μm de diámetro, 0,48 NA, lentes dóricas) con la punta en el lugar de la inyección para la posterior adquisición de la señal GCaMP6f. . Los ratones Hcrt-cre+ y Hcrt-cre- (control) recibieron un tratamiento viral idéntico.

Los animales fueron entrenados primero para aprender dónde ocurre la entrega de la recompensa entrenándolos en un programa de intervalo aleatorio de 60 s hasta que investigaron de manera confiable el puerto de recompensa de los toques en la nariz (>200 toques en la nariz por sesión) y los toques en la nariz de manera confiable durante el período de recompensa ( hasta que ~80% de los períodos de recompensa mostraron al menos un golpe en la nariz). Después de esto, los ratones fueron entrenados en el 'Go Cue' en una sesión de 40 minutos o 60 ensayos (lo que ocurriera primero) de solo ensayos de Go Cue. Una vez que los ratones respondieron de manera confiable a Go Cue (>70% de respuesta precisa a Go Cue durante tres días de entrenamiento consecutivos), se introdujo el 'NoGo Cue' de modo que la sesión de prueba de 40 min/60 fuera una distribución aleatoria de 50% de pruebas de Go y 50% de pruebas NoGo. Una vez que los ratones respondieron de manera confiable y precisa a las señales Go y NoGo (>70% de respuestas correctas a las señales durante tres días de entrenamiento consecutivos), se consideró que los ratones estaban listos para la prueba. Se mantuvo una precisión confiable entre los días de prueba con entrenamiento regular (al menos 5 días a la semana); los ratones solo fueron evaluados si su sesión de entrenamiento más reciente mostró> 70% de precisión en las señales Go y NoGo (Fig. 5).

Después de un período de Precue de duración variable (duración de 9 a 24 s, luz de la jaula encendida), los períodos Go y NoGo (duración de 10 s o hasta que se pinche la nariz, luz de la jaula encendida) se envían al animal mediante una señal auditiva distinta. ITI significa intervalo entre pruebas (duración 10 s, luz de la jaula apagada). Las respuestas prematuras durante el período Pre-Cue y las respuestas incorrectas durante el período Cue desencadenan la progresión al ITI, al igual que la conclusión del período de recompensa (duración 3 s, luz de la jaula encendida). Los cuadros sombreados indican respuestas incorrectas.

Se calcularon los siguientes parámetros por sesión: Golpes: el número de veces que un animal produce un golpe en la nariz durante el período de referencia de una prueba de Go en una sesión particular; Falsas alarmas: el número de pruebas de NoGo en las que el animal se tocó la nariz durante el período de señal de NoGo; Tasa de respuesta de PreCue: el número total de respuestas realizadas durante todos los períodos de precue y se divide por la duración total de todos los períodos de precue. Si no se produjo ningún toque durante la presentación de la señal, el valor se establece en la latencia máxima (tiempo máximo de presentación de la señal).

Para un registro de fotometría de fibra, se conectaron ratones Hcrt-cre+ y Hcrt-cre- a un cable de grabación flexible y se colocaron en la cámara operante. Allí, su señal GCaMP6f se registró durante 12 minutos, 1 minuto de registro de referencia mientras el ratón descansaba en la jaula operante sin ninguna tarea en ejecución, y luego 10 minutos de pruebas Go/NoGo (proporción 50:50 de pruebas Go a NoGo). , seguido de un minuto adicional de grabación posterior a la sesión. Las grabaciones se capturaron utilizando equipos como se describió anteriormente55,56. Brevemente, se module de forma sinusoidal una luz de excitación de 470 nm (M470F3, Thorlabs, Nueva Jersey, EE. UU.) a 211 Hz utilizando un programa Matlab personalizado (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) y un dispositivo de adquisición de datos multifunción (NI USB-6259, National Instruments, Austin, Texas, EE.UU.). La luz de excitación pasó a través de un filtro de excitación GFP (MF469-35, Thorlabs) y se reflejó mediante un espejo dicroico (MD498, Thorlabs) en un cable de conexión de baja fluorescencia (400 µm, 0,48 NA; lentes dóricas) a través de un paquete de colimación de fibra (F240FC). -A, Thorlabs). El cable de conexión se conectó a la fibra óptica implantada en el animal a través de una funda de circonio (SLEEVE_ZR_2.50, Doric Lenses). La fluorescencia de GCaMP6f se recogió a través del cable de conexión y se pasó a través de un filtro de emisión GFP (MF525-39, Thorlabs) y se enfocó en un fotodetector (LA1540-A, Thorlabs; Modelo 2151, Newport, Irvine, CA, EE. UU.). Luego, la señal se envió a un amplificador de bloqueo (constante de tiempo de 30 ms, modelo SR830, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA, EE. UU.) sincronizado a 211 Hz y luego se recopiló a 1 KHz con un script Matlab personalizado y un dispositivo de datos multifunción. dispositivo de adquisición (National Instruments). Las señales de GCaMP6f se alinearon con los comportamientos en la cámara operante mediante pulsos TTL enviados desde la cámara operante y se registraron en un flujo de datos paralelo mediante un script Matlab personalizado. Para cuantificar el cambio de las señales de GCaMP6f, los valores antes de las transiciones de estado se promediaron como línea de base, y se determinó y promedió el tamaño del área (ΔF/F integral) entre la línea de base y el rastro de la señal de GCaMP6f para cada ratón individual.

Para examinar el efecto de la estimulación de las neuronas Hcrt en la tarea Go/NoGo, se conectaron ratones Hcrt-cre+ y Hcrt-cre- mediante un cable de conexión de fibra óptica a un láser. La intensidad de la luz se calibró a 10 mW en la punta con un fotómetro (Thorlabs). Luego, se conectó un cable de conexión de fibra óptica (MFP_200/240/900-0.22_3.0m_FC-MF2.5, lentes dóricas) al implante de fibra de vidrio a través de una funda de circonio (SLEEVE_ZR_2.50, lentes dóricas). Para verificar la colocación de las fibras, se confirmó que los animales se despertaron (iniciaron el movimiento) dentro de los 20 s de estimulación (5 s a 5 Hz, ancho de pulso de 10 ms, 10 mW) administrada durante un comportamiento similar al sueño sostenido (más de 30 segundos), como se informó en otro lugar57 ,58. Dado que la integridad del tejido se vio comprometida en el tejido no fijado, la localización anatómica de la cánula se verificó post mortem en un grupo separado de animales (consulte la Figura 2 complementaria). Después de acostumbrarse al aparato Go/NoGo con conexión de fibra óptica, se realizó estimulación optogenética con frecuencias variables en diferentes puntos durante las pruebas Go/NoGo (intensidad de la luz en la punta de la fibra: 10 mW, ancho del pulso de luz: 15 ms; 5 y 10 Hz). Se realizó estimulación durante 5 s). El momento de la estimulación con láser se distribuyó aleatoriamente entre 4 condiciones de prueba: (1) sin estimulación con láser; (2) estimulación láser durante los últimos 5 s del período PreCue; (3) estimulación láser durante los primeros 5 s del período Go Cue; y (4) estimulación láser durante los primeros 5 s del período NoGo Cue. Los parámetros de estimulación optogenética se seleccionaron en base a validaciones previamente informadas de estimulación optogenética Hcrt de nuestro laboratorio18,56.

Para la colocalización de la expresión de ChR2/GCaMP y la inmunorreactividad de la hipocretina, perfundimos transcardialmente a los ratones con tampón fosfato seguido de paraformaldehído tamponado al 4% (pH 7,4). Luego, los cerebros extraídos se fijaron posteriormente en paraformaldehído al 4% durante 2 h antes de colocarlos en una solución de sacarosa al 30% para crioprotección durante 48 h. Luego se seccionaron los cerebros en un criostato Leica a 30 um y se almacenaron en tampón fosfato hasta la tinción. Las rebanadas se bloquearon en una solución de albúmina sérica bovina al 5 %/Triton al 0,5 % durante 1 hora a 36 °C. Luego, las rebanadas se incubaron en un anticuerpo primario contra la hipocretina-A (Abcam ab6214) en una dilución de 1:250 en BSA al 3 %/Triton al 0,3 %. solución durante la noche a 4 C. Luego se lavaron las rodajas en PBS seguido de la incubación con AlexaFlour594 a una dilución 1:1000 en una solución de BSA al 3 %/TritonX100 al 0,3 % a 36 C durante 1,5 a 2 h. Luego las rodajas se lavaron en PBS y luego se montaron con DAPI.

Todos los análisis estadísticos se completaron con GraphPad Prism 8.4.1. Los datos de fotometría de fibra se analizaron mediante análisis de varianza de medidas repetidas (RM-ANOVA) utilizando el tipo de transición y el tiempo (antes y después de la transición) como factores estadísticos. Debido a los tamaños de muestra desiguales entre las respuestas de las pruebas, los datos de fotometría de fibra de la transición Precue-to-Cue se analizaron utilizando un modelo de efectos mixtos. El efecto de las frecuencias de estimulación optogenética de Hcrt sobre el comportamiento se evaluó utilizando RM-ANOVA con la frecuencia de estimulación y el genotipo como factores estadísticos. De manera similar, se analizó el efecto del tratamiento farmacológico sobre la conducta mediante RM-ANOVA con el genotipo y el tratamiento como factores. Las pruebas de comparaciones múltiples de Bonferroni se realizaron post hoc para investigar las diferencias de grupos específicos (Datos complementarios 1). Fuente de datos para las Figs. 2 a 4 se pueden encontrar en los Datos complementarios 2.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio digital de Stanford [https://purl.stanford.edu/sf095mv6553. https://doi.org/10.25740/sf095mv6553].

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Este trabajo fue financiado por subvenciones de Boehringer Ingelheim y NIH (R01HL150566, R01MH116470, R01MH102638) y LdLKJJ recibió una beca postdoctoral NRSA (F32HD095597). SMT contó con el apoyo de una beca posdoctoral Philip Wrightson.

Susan M. Tyree

Dirección actual: Atlantia Clinical Trials, Cork, Irlanda

Kimberly J. Jennings

Dirección actual: Universidad de Texas, Austin, TX, EE. UU.

Departamento de Psiquiatría y Ciencias del Comportamiento, Facultad de Medicina de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Susan M. Tyree, Kimberly J. Jennings, Oscar C. Gonzalez, Shi-bin Li & Luis de Lecea

Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, Biberach, Alemania

Janet R. Nicholson y Moritz von Heimendahl

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

JRN, MvH y LdL concibieron este trabajo. SMT realizó todos los experimentos de comportamiento, registros de calcio y optogenética y analizó los datos. KJJ realizó registros y análisis de calcio. OCG y S.-BL verificaron la ubicación anatómica de la cánula y realizaron inmunohistoquímica. JRN, MvH y LdL supervisaron el trabajo. LdL escribió el manuscrito con aportaciones de todos los autores.

Correspondence to Luis de Lecea.

JRN y MvH declaran tener los siguientes intereses en competencia: Son empleados a tiempo completo de Boehringer Ingelheim. Todos los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Karli Montague-Cardoso y George Inglis.

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Tyree, SM, Jennings, KJ, González, OC et al. Las intervenciones optogenéticas y farmacológicas vinculan las neuronas de hipocretina con la impulsividad en ratones. Común Biol 6, 74 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04409-w

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Recibido: 26 de febrero de 2021

Aceptado: 03 de enero de 2023

Publicado: 19 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04409-w

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Intervenciones optogenéticas y farmacológicas vinculan las neuronas de hipocretina con la impulsividad en ratones